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《中国农业科学院》 2004年
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利用噬菌体展示技术鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原表位

安同庆  
【摘要】:抗原表位,又称抗原决定簇,是抗原分子抗原性的基础。正确而详细地绘制抗原表位图谱对疾病的诊断、设计无毒副作用的多表位疫苗以及免疫治疗试剂等具有积极的意义。因此目前在预防医学领域许多关于以表位为基础的如表位疫苗和特异性诊断试剂等的研究也就成了热点。而噬菌体展示技术作为近年来新兴起的研究蛋白质抗原表位的有利工具,已经成功地鉴定出了多种病原微生物的抗原表位。这就为揭示一些病原体未知的抗原表位,从而进一步达到预防和控制疾病的发生提供了条件。 猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRSV引起的,以妊娠母猪的繁殖障碍以及各年龄猪呼吸道症状为特征的一种传染病。该病于1987年首次在美国发现,目前,已广泛流行于世界各国,给养猪业造成了巨大的经济损失。1996年我国分离到第一株PRRS病毒,命名为CH-1a株。虽然对该病毒的一些分子生物学特已经进行了深入研究,但迄今为止,对于CH-1a株的抗原表位还没有报道。为深入了解CH-1a株的抗原结构,便于设计科学合理的疫苗和诊断试剂,我们对PRRSV CH-1a株进行了抗原表位的鉴定。 本研究利用噬菌体随机7肽库对PRRSV CH-1a N蛋白的单克隆抗体N3H2进行了3轮筛选,得到了3个模拟表位:“STTPFKK”、“TKHPQFV”和“STGNRLT”。为进一步研究表位结构,本研究构建了PRRSV ORF7基因特异性肽库,利用N3H2进行了3轮筛选,获得3个阳性噬菌体克隆。序列分析表明,这3个克隆都展示有“IQTAFNQGA”9个氨基酸的序列,对应于PRRSVCH-1a株N蛋白的79-87位氨基酸残基(aa 79-87)。人工合成这段表位编码序列并进行原核表达,利用单抗N3H2对表达产物进行Western blot分析和ELISA鉴定,均为阳性。由此表明IQTAFNQGA为PRRSV CH-1a株的一个线性B细胞抗原表位,并将其命名为Ep703。 通过序列比较发现,Ep703与Meulenberg等(1998)在LV株N蛋白中鉴定的一个构象表位(由aa 51-67与aa 80-90构成)的aa 80-88序列完全相同,而CH-1a株aa 50-66与LV株aa 51-67相比较,发现二者存在2个氨基酸的差异(LV A~(60)→CH-1a T~(59)和LV L~(65)→CH-1a R~(64))。LV株N蛋白含有2个半胱氨酸(C~(27)、C~(76)),而CH-1a株中含有3个半胱氨酸(C~(27)、C~(76)和C~(90)),因此二者的N蛋白在通过二硫键形成高级结构的方式可能不同,导致两种蛋白具有不同的空间结构和抗原性。二级结构分析发现,aa 79-87区域以β折叠为主,这种构型有助于表位的形成。蛋白的三维结构显示,Ep703的9个氨基酸多肽暴露于蛋白的表面。3个模拟表位与表位Ep703的序列“IQTAFNQGA”相比,相同的氨基酸很少,但是各表位氨基酸的极性却有一个共同的特征:亲水性氨基酸比例较大,疏水性氨基酸比例较少。通过与GenBank中41株美洲型分离株的N蛋白的序列进行比较,发现Ep703的序列在美洲型毒株中高度保守。因此,我们鉴定的表位Ep703是一个在美洲型毒株中保守的线性B细胞抗原表位。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S852.65

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