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《中国农业科学院》 2004年
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葡萄糖氧化酶基因和草酸氧化酶基因在甘蓝型油菜中的表达研究

董祥柏  
【摘要】:核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]是一种广谱性病原真菌,能危害75科400多种植物。在我国,S.sclerotiorum在大豆、油菜、向日葵和十字花科蔬菜上引起严重的菌核病,造成巨大的经济损失。研究表明,草酸毒素在S.sclerotiorum致病过程中起关键作用。遗憾的是,人们至今尚未发现对S.sclerotiorum免疫的或有效的天然抗源。 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GO)在有氧条件下催化β-D葡萄糖生成葡萄糖酸,并以O_2为电子受体结合质子形成H_2O_2。草酸氧化酶(oxalate oxidase, OXO)能够把毒素草酸降解为CO_2和H_2O_2。葡萄糖酸作为代谢的中间产物可通过糖醛酸途径或磷酸戊糖途径进一步被利用。CO_2是植物光合作用的原料,可被植物再固定。H_2O_2是活性氧类的一种,具有直接的抑菌活性,又可作为信号分子诱发植物的过敏反应、系统获得性抗性等防卫反应,增强植物的抗病性。 因此,通过基因工程的手段,把GO基因和OXO基因导入寄主植物,来增强寄主植物广谱抗病性或提高寄主植物对S.sclerotiorum抗性,培育抗病品种或种质,在生产上具有重要的意义。 本研究以来源于小麦的germin基因和来源于Aspergillus niger的GO基因为外源基因,以pBI121为基础,构建OXO单基因和GO/OXO双基因两个植物表达载体,并利用本课题组保存的GO基因植物表达载体,以子叶柄为外植体,采用农杆菌介导的遗传转化方法,对甘蓝型油菜进行转化;获得了转OXO基因和GO基因的单、双价转基因工程油菜,其中,转OXO基因油菜12株,转GO基因油菜9株,转GO/OXO双基因油菜6株。通过加代扩繁,目前已获得了T_2代转基因油菜株系。 PCR检测和Southern杂交证明,GO基因和OXO基因已整合到转基因油菜的基因组中。 ELISA检测表明,GO在转GO基因油菜中得以表达,A_(450)最低0.124,最高0.673,相差5倍以上,这表明GO基因在转基因油菜得到表达,但不同转基因株系之间表达水平可能有很大差异。对转OXO基因油菜进行了OXO酶活性(以OD_(550)表示)分析表明,非转基因油菜OD_(550)值在0.13以下,转OXO基因植株的酶活性在0.17以上,比非转基因油菜高30.7%,最大0.4512,是非转基因油菜的4.23倍。用超氧钛法测定了转GO基因油菜中H_2O_2含量。每克转GO基因油菜叶片H_2O_2含量大多在220μ M以上,比非转基因油菜高46.9%,最高含量为656μ M,是非转基因油菜H_2O_2含量4.37倍。 采用离体叶接种法对转GO基因油菜T_1代G803株系进行菌核病抗性鉴定。方差分析表明,转基因油菜和非转基因油菜抗病性差异显著,在转GO基因油菜上菌丝侵染迟,扩展慢,对S.sclerotiorum的抗性明显提高。对转OXO基因油菜和转OXO/GO双价基因油菜菌核病抗性鉴定尚未完成。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S565.4

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【引证文献】
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