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《中国农业科学院》 2003年
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苏云金芽孢杆菌cry1le1和cry8基因的研究

宋福平  
【摘要】:cry1Ie1基因是我国鉴定分离并经国际命名的一种新型的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白基因。该基因在Bt菌株中沉默,编码719个氨基酸组成的蛋白,对小菜蛾(Plutella xylostella)、玉米螟(Ostrinia furnacalis)和大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella)等害虫具有较高的杀虫活性。本研究通过PCR扩增的方法,以cry1Ie1全长基因为模板,分别得到不同末端缺失的基因片段,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达,得到6种末端缺失的蛋白。通过对小菜蛾和玉米螟生物测定确定Cry1Ie1蛋白对小菜蛾的最小活性区N端在45-104氨基酸位点之间,C端在633-648氨基酸位点之间。N端的45个氨基酸对于玉米螟的杀虫活性的是必需的,而C端活性区应在633-648氨基酸位点之间。最终明确1-648氨基酸对小菜蛾和玉米螟均与全长蛋白活性相当或略高。 在上述研究基础上,对编码Cry1Ie1蛋白1-648氨基酸的核酸序列进行的序列改造和密码子优化,使其能在植物中高效表达。经过优化人工合成的cry1Iem基因与原基因的同源性只有82.8%,而G+C含量也由原来cry1Ie1的37.04%提高为47.22%。原核表达的Cry1Iem蛋白与Cry1Ie1活性相当。 苏云金芽孢杆菌cry8类基因对叶甲科、金龟科等多种鞘翅目害虫均具有毒杀作用。,本研究建立了cry8类基因的鉴定体系,从我国分离的36株Bt菌株中鉴定出15株含有cry8类基因,主要分为两种类型,RFLP图谱分析表明以HBF-1为代表的3株含有cry8Ca基因,而以185菌株为代表的12株含有新型cry8基因,进一步克隆了185菌株该基因的部分序列,发现与已知cry8基因序列存在较大差异。 克隆了菌株HBF-1和H06菌株中cry8Ca基因,它们之间只存在1个氨基酸的差异,在Bt菌株无晶体突变株HD-73~-中获得高效表达,并对铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)幼虫蛴螬有较高的杀虫活性,在160μg/g土土壤浓度下,14天校正死亡率达68.3%。从Bt菌株185中克隆一种新型的cry8基因。该基因与已知cry8基因的同源性均低于78%,已在GenBank登录(AY329081),并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry8Ea1基因。这是我国发现的第一个第二等级的Bt杀虫基因,杀虫活性的研究正在进行。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S476

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