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《中国农业科学院》 2003年
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猪圆环病毒2型基因的原核表达与单克隆抗体的制备及感染性分子克隆的动物接种试验

韩凌霞  
【摘要】:猪圆环病毒2型(PCV2)是近来发现严重影响养猪业的一种猪源病毒,生产实践中常与多种病原混合感染,造成形式多样、病理复杂的临床症状,尤其是断乳仔猪的腹泻、呼吸困难、严重消瘦、贫血,偶尔伴有黄疸,随着其感染的病原不同,死亡率也有很大差异。从文献报道可知,PCV2各毒株与地域和时间没有明显的相关关系,但的确存在核苷酸序列差异,这对其生物学特征有何影响还未有定论。 为了了解我国PCV2株的生物学特点,我们从当地患有严重消瘦和贫血的仔猪抗凝血中利用体外培养技术分离到一株PCV2病毒,并构建了基因组重组克隆pMDT-PCV。将分离株命名为JXL,登录GenBank,登录号为AY491310。通过序列分析,与参考株比较出现了内切酶位点的突变,如ClaI和XbaI的缺失。选取不同地域的毒株比较,与包括美国的34464株、台湾Chia-Yi株、德国IAF-4370株和加拿大24657 NL株在内的不同地域比较,核苷酸同源性分别为95.5%、93.9%、95.6%和99.5%,证明地域不同与毒株核苷酸序列保守性没有明显的相关性。 由于从病料分离的PCV2毒株常混有猪细小病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒以及内源性的PCV1病毒等,为了准确地研究PCV2病毒单因子自身在复制和致病性等方面的作用机制,我们将pMDT-PCV分子DNA克隆转染PK15细胞系,其衍生病毒可与PCV2多抗血清在间接免疫荧光抗体试验中(IFA)显示特异性的荧光,表明具有体外感染性。 在此基础上,通过腹股沟淋巴结接种3头30日龄仔猪pMDT-PCV分子DNA,每头每次500ng,分别免疫2或3次,1头共圈饲养观察有无水平感染。发现50天后,接种猪血清的荧光抗体效价在1:500以上,淋巴组织中淋巴小结数增多,生发中心和副皮质区的淋巴细胞数减少,结构模糊:肝淤血,窦内淋巴样细胞浸润;肺细支气管周围淋巴细胞浸润,个别地方有小肺炎灶,肺泡膈增宽;心脏和肾末见明显异常。用免疫3次猪的剖杀猪血清检测组织中的特异性抗原,发现在肾小球和淋巴结的生发中心存在大量的抗原物质。但利用套式PCR始终未从血清中扩增出PCV2特异性片断,说明病毒的复制能力较弱或者病毒血症持续时间非常短。共圈饲养的空白对照猪,出现了轻微的组织学变化,从肾和淋巴结中也存在少量的荧光特异性抗原,血清抗体效价为1:250,表明发生了水平感染。 分子DNA克隆的体内、体外接种试验表明,pMDT-PCV具有感染性,能通过衍生病毒的复制对猪淋巴器官产生轻微病变,但不表现临床症状,反映了PCV2病毒的复制能力差、致病性弱等特性,也说明临床上发生的PCV2相关疾病需要其它病原或刺激剂的共同作用。 PCV2主要编码2种蛋白,与复制相关的ORF1编码Rep蛋白和唯一的结构蛋白由ORF2编码。为了方便深入研究PCV2,设计并合成3对引物,通过PCR 博七后出站报告 中文摘要 中国农科院研究生院 扩增出PCVZ完整的ORFI基因和ORFZ基因的N一末端(PCV737-42;)和C一末端 (PCV421_3:),并根据T-A原理构建成功转移载体pMDT-O好1、pMDT-PC叭3742, 和pMD下PCV42,一37。在此基础上,分别利用带有6xHis残基的原核表达系统 PPROHTb载体在大肠杆菌DH5a中构建了重组质粒pPRO.R印,融合表达为重组 蛋白His一R叩;利用带有谷肤普肤一S一转移酶的pGEX一6p一1载体在BL21中构建了 重组质粒pGEX一PCv737一t和pGEX一PCV42卜3:,融合表达为重组蛋白 GsT-PcV737、2,和GsT-pcv421一3:。利用超声波破碎的重组菌pGEx一PCV421一7菌体 蛋白,1:50稀释时包被酶标检测板,建立了间接ELISA方法,与1:1000稀释 的PCVZ标准阳性血清和阴性血清的P加比值高达2.11,表明可用于PCVZ的血 清学诊断。将通过SDS一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS一PAGE)初步纯化的重组蛋白 GST-PCV737、2,和GST-PCV42,一3:分别免疫BALB/e小鼠,获得的鼠抗血清1:40 稀释时,均可通过.正A检测出PK15细胞培养的PCVZ病毒,表明重组蛋白具有 针对病毒的反应原性。 利用SDS一队GE初步纯化的重组外源蛋白GST-PCV737421,免疫BALB/c小 鼠。取脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合后,通过正A筛选,获得5个PCVZ特异 性单克隆抗体分泌细胞株,2F10、3G2、4G3、4G4和4E12。通过体内诱生法大 量生产抗体,测得各单抗腹水的正A效价约为1:2000。对单抗3G2进行染色体 分析,染色体数约为80对左右。3G2腹水1:100稀释时能从重组菌 pGEx一PCV737、2、菌体总蛋白中利用蛋白印迹试验(Western七lot)清晰地检测出 重组蛋白GST-PCV737书l。 通过扩增PCVZ ORFZ基因,利用质粒载体pE下30a构建了重组克隆 PET-caP,在此基础上,利用ORFZ基因中421位的Ec口RJ位点,插入无同源性 的猪生长抑素基因(somatostain,55)约1 SObP片段,构建了PCvZ竞争性PCR 模板。通过琼脂糖凝胶电泳,可利用澳化乙锭染色区别出880bp的竞争片段 CaP一SS和700bP的目的片段CaP,建立了PCVZ竞争性PCR方法。并用此方法, 测得本研究中通过组织培养和超速离心获得的病毒粒子达10’5拷贝/微升。 本研究通过大量细致的基础工作,制备了血清学诊断和病原学诊断的基础试 hlJ,为下一步寻找PCVZ抗原表位和建立鉴别诊断试剂以及进行对病毒进行量化 研究提供了条件。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S852.65

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
1 曹彦琼;猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定[D];南京农业大学;2011年
2 徐恒;猪圆环病毒2型单克隆抗体的研制和基于单抗的检测PCV2抗原的免疫组化法的建立及其初步应用[D];扬州大学;2010年
3 姚永红;猪圆环病毒2型间接ELISA检测方法的建立及抗ORF2蛋白单克隆抗体的制备[D];山东农业大学;2012年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 龚振华,尹燕博,沈广;猪圆环病毒:一种新发现的病原[J];中国预防兽医学报;2000年S1期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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2 郝贵增;靳玉芬;;猪圆环病毒的分子生物学研究进展[J];安徽农业科学;2007年13期
3 陈杨;徐志文;郭万柱;陈弟诗;;猪圆环病毒2型的致病机理和疫苗研究进展[J];安徽农业科学;2007年18期
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9 马其国;商绍彬;申会刚;;猪圆环病毒2型诊断技术的研究进展[J];浙江畜牧兽医;2008年05期
10 郭春艳;葛俊伟;李一经;;猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达[J];东北农业大学学报;2009年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 梁鹏帅;蔡汝健;刘燕玲;孙瑞芹;张龙现;宋长绪;;华南地区猪圆环病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒检测分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
2 翟少伦;陈胜男;张建武;韦祖樟;龙进学;袁世山;魏文康;陈琴苓;宣华;吴大成;;猪圆环病毒感染人类的可能途经剖析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
3 李曦;符芳;王靖飞;崔尚金;童光志;;断乳仔猪多系统衰竭综合征的病原学调查[A];2005辽宁省畜牧兽医学会养猪研究会学术年会论文集[C];2005年
4 朱凤霞;;猪圆环病毒的分子生物学研究进展[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
5 银梅;唐海蓉;陈桂香;王选年;王新华;;断奶仔猪多系统衰弱综合征[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十三次学术讨论会和中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十二次学术讨论会论文集[C];2005年
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7 何逸民;齐岩;何兆祥;罗玉均;潘全会;孔留五;曹宗喜;张桂红;;猪圆环病毒2型ORF2的原核表达及抗原性分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会成立大会暨第一次学术研讨会论文集[C];2008年
8 吴志明;闫若潜;贾松涛;张志凌;张健;黄清;;猪圆环病毒2型ORF2/猪白介素2嵌合基因真核表达载体的构建、表达及在动物体内免疫效果研究[A];中国畜牧兽医学会2008年学术年会暨第六届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2008年
9 谢彩华;闫若潜;吴志明;张志凌;张健;陈涛;;猪圆环病毒2型ORF2基因的表达及活性研究[A];中国畜牧兽医学会小动物医学分会第四次学术研讨会、中国畜牧兽医学会兽医外科学分会第十六次学术研讨会论文集(2)[C];2009年
10 魏战勇;贾艳艳;陈红英;崔保安;;猪圆环病毒2型SYBR-Green 1实时荧光定量PCR检测方法的建立[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集(下册)[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 尹双辉;猪圆环病毒2型衣壳蛋白病毒样颗粒的制备及其免疫原性的研究[D];中国农业科学院;2011年
2 邢福珊;PCV-2 ORF2蛋白在杆状病毒表面的展示及动物免疫试验[D];西北农林科技大学;2011年
3 李文良;中国东部PCV2分子流行病学与PCVD亚单位疫苗抗原分子研究[D];南京农业大学;2011年
4 刘翠权;广西395个规模猪场猪呼吸道疾病综合征的病原学调查及防控措施[D];南京农业大学;2011年
5 王忠田;猪圆环病毒2型ORF2基因表达及重组蛋白ELISA方法的建立[D];中国农业大学;2003年
6 芦银华;华东地区猪圆环病毒2型的分子流行病学调查及其感染性核酸的构建[D];南京农业大学;2003年
7 周双海;猪圆环病毒2型感染对猪肺泡巨噬细胞功能的影响[D];中国农业大学;2004年
8 温立斌;猪圆环病毒2型的分子流行病学研究[D];中国农业大学;2005年
9 宋勤叶;表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白重组质粒的构建及免疫效应[D];中国农业大学;2005年
10 秦晓冰;PCV2核酸疫苗和重组鸡痘病毒疫苗的构建及实验免疫研究[D];吉林大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 宋飞;猪圆环病毒2型(WH株)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒混合感染致病性的研究[D];华中农业大学;2010年
2 逄莎莎;PCV2人工感染对仔猪免疫器官的影响以及PCV2-WH株灭活疫苗的保护作用研究[D];华中农业大学;2010年
3 祁艳华;猪圆环病毒2型ELISA抗体检测方法的建立及PCV2单克隆抗体的制备[D];郑州大学;2010年
4 刘宗争;PCV2 ORF2基因在大肠杆菌中的表达及与PCV2灭活抗原免疫效果的比较[D];山东农业大学;2010年
5 苏金存;猪圆环病毒2型油乳剂灭活疫苗及其免疫效力研究[D];安徽农业大学;2010年
6 李超;安徽地区猪圆环病毒2型的流行病学调查及地方株的特性研究[D];安徽农业大学;2010年
7 王建立;猪圆环病毒2型感染对猪肺泡巨噬细胞模式识别受体转录水平的影响[D];中国农业科学院;2010年
8 石运通;猪圆环病毒Ⅱ型核酸疫苗的构建及间接ELISA方法的建立[D];福建农林大学;2010年
9 翟少伦;猪群中三种新发小DNA病毒的分子流行病学研究[D];新疆农业大学;2010年
10 邵小雪;嵌合猪圆环病毒的构建及其对仔猪的免疫原性[D];新疆农业大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 胡春艳;刘全忠;;单克隆抗体制备技术及应用的研究进展[J];安徽预防医学杂志;2008年02期
2 曹胜波,陈焕春,肖少波,赵俊龙,吕建强,钱平;猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组克隆与序列分析[J];病毒学报;2002年02期
3 张应国;张文东;宋建领;张富强;;猪圆环病毒基因组结构及其分子特征研究进展[J];动物医学进展;2006年07期
4 琚春梅;;猪圆环病毒复制与转录模式研究进展[J];动物医学进展;2007年04期
5 马贯中;韩凌霞;朴范泽;刘怀然;司昌德;姜骞;曲连东;;猪圆环病毒Cap蛋白羧基端特异性单克隆抗体的制备[J];黑龙江八一农垦大学学报;2006年02期
6 佟有恩,焦静波,田荣福,时洪艳;猪圆环病毒Ⅱ型引起的断乳仔猪全身性消瘦综合征[J];黑龙江畜牧兽医;2002年11期
7 曹胜波,陈焕春,肖少波,何启盖,徐引弟,刘军发;猪环状病毒2型的PCR检测方法的建立及应用[J];华中农业大学学报;2001年01期
8 杨家华;猪圆环病毒感染研究进展[J];青海畜牧兽医杂志;2004年02期
9 郗鑫,陈焕春,李川,刘正飞,曹胜波,琚春梅;猪Ⅱ型圆环病毒ORF1基因克隆及在E.coli中的表达[J];中国生物化学与分子生物学报;2004年03期
10 陈庆新,周继勇,叶菊秀,申会刚,陈婷飞;猪Ⅱ型圆环病毒浙江株的分离及全基因组结构分析[J];微生物学报;2004年04期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 曹胜波;猪圆环病毒感染性分子克隆构建及siRNA对rep基因表达抑制研究[D];华中农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 宋益;嵌合型猪圆环病毒2型感染性DNA克隆的构建及其免疫原性研究[D];扬州大学;2005年
2 陈美玲;抗猪圆环病毒Ⅱ型ORF2蛋白单克隆抗体的制备鉴定及Ⅰ型ORF2功能基因的研究[D];华中农业大学;2005年
3 郭振光;猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及其在PCV2抗体检测ELISA方法建立和单克隆抗体制备中的应用[D];扬州大学;2007年
4 陈长春;猪圆环病毒衣壳蛋白的表达及其单克隆抗体的制备[D];扬州大学;2007年
5 叶俊平;2005年、2006年江苏地区猪高热病病例中PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV感染的多重PCR检测及PRRSV分离株部分基因序列分析[D];扬州大学;2007年
6 丛丽媛;猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及表达产物在ELISA建立和单克隆抗体制备中的应用[D];西北农林科技大学;2007年
7 边少国;猪圆环病毒Ⅱ型特异性单克隆抗体的研究[D];吉林农业大学;2007年
8 朱丽娜;2007年江苏地区猪高热病病例中PCV2、PPV、PRV、PRRSV、CSFV、JEV、EMCV、PEV、PTV的检测和区分猪瘟野毒、疫苗毒荧光定量RT-PCR方法的尝试[D];扬州大学;2008年
9 程旭;嵌合型猪圆环病毒PCV1-2及PCV2 ORF2真核表达质粒对商品猪的免疫保护试验及间接免疫荧光检测PCV2抗体方法的建立[D];扬州大学;2008年
10 元永平;猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白单克隆抗体的制备和鉴定[D];西北农林科技大学;2008年
【二级引证文献】
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1 马攀攀;猪圆环病毒2型ORF2截短基因的原核表达及其单克隆抗体的研制和应用[D];河南农业大学;2012年
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2 王亚玲,胡国富,李群,胡宝忠,何祖华;水稻抗病调控因子OsSGT1原核表达载体构建和表达蛋白纯化[J];东北农业大学学报;2004年03期
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8 丁炜东;曹丽萍;吴婷婷;;奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素前体蛋白的克隆与表达[J];生物技术;2005年06期
9 边传周;乔宏兴;;IBDV H1株VP2基因的原核表达及其产物的复性[J];中国兽医科学;2006年05期
10 杨学山;胡永浩;逯忠新;;猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白基因的原核表达[J];甘肃农业大学学报;2007年04期
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1 辛英豪;高继明;刘标;李莎莎;姜世金;;Ⅰ型鸭病毒性肝炎VP1基因的克隆与原核表达[A];山东畜牧兽医学会禽病学专业委员会第一次学术研讨会论文集[C];2009年
2 焦石;贾立军;薛书江;刘明明;黄国明;张守发;;牛源犬新孢子虫MAG1基因的克隆及原核表达[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
3 彭跃跃;丁燏;简纪常;鲁义善;;南极衣藻γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHI)基因的克隆,原核表达及定量分析[A];渔业科技创新与发展方式转变——2011年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2011年
4 岳亮;王艺磊;张子平;林鹏;邹志华;谢芳靖;陈锦民;冯建军;;日本囊对虾Cathepsin B基因的克隆与原核表达[A];中国甲壳动物学会第十一届年会暨学术研讨会论文摘要集[C];2011年
5 孟先明;潘艳;蔡新斌;陆专灵;梁湘;唐海波;杨剑;张红普;罗廷荣;;狂犬病毒ERA株基质蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备[A];2010全国狂犬病防控高层论坛论文集[C];2010年
6 赵刚;李刚;范晓娟;;狂犬病病毒P基因的原核表达及间接ELISA方法的应用[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第二次学术研讨会论文集[C];2010年
7 李凯;高宏雷;祁小乐;高玉龙;高立;邓小芸;王笑梅;;禽网状内皮组织增生病病毒env基因的原核表达及其多克隆抗体制备[A];全球肉鸡产业论坛暨第二届中国白羽肉鸡产业发展大会会刊[C];2010年
8 宋艳;柳学广;朱晓苏;徐丽;司马杨虎;徐世清;;野桑蚕Bmand-Sxl基因的克隆及原核表达[A];中国蚕学会第六届青年学术研讨会论文集(1)[C];2009年
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10 刘冠楠;姜建国;;盐生杜氏藻3-磷酸甘油脱氢酶基因的原核表达及酶学性质分析[A];2010年中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会学术年会暨华南地区农产品加工产学研研讨会论文摘要集[C];2010年
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1 吴一福;我学者首次发现抗HBV末端蛋白杂交瘤细胞系[N];中国医药报;2006年
2 宋冬 何玉玺;祖国的需要,就是我们最好的选择[N];科技日报;2009年
3 本报记者 伊洁 张颖;“挑战杯”的胜利者[N];福建日报;2005年
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8 本报首席记者 任荃;一石三鸟“里葆多”[N];文汇报;2009年
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1 陈立志;牛源致病性坏死梭杆菌分离鉴定及其白细胞毒素免疫特性研究[D];吉林大学;2008年
2 赵宇军;猪戊型肝炎病毒结构蛋白基因表达及其基因特异性噬菌体展示肽库构建[D];中国农业科学院;2005年
3 韩俊友;牛蛙皮肤抗菌肽分离纯化、基因克隆表达及生物学特性的研究[D];吉林大学;2007年
4 李静;海洋酵母菌Metschnikowia reukaufii W6b酸性蛋白酶的生产、基因克隆和表达的研究[D];中国海洋大学;2008年
5 游向荣;龙眼成花转变与成花逆转的差异蛋白质组学研究[D];福建农林大学;2009年
6 许波;抗菌/抗内毒素多肽葛佬素的表达、纯化及其生物活性的初步研究[D];第四军医大学;2004年
7 孙照刚;传染性喉气管炎病毒糖蛋白G基因的克隆、表达、蛋白功能研究以及缺失该基因病毒的重组[D];中国农业大学;2005年
8 郑银英;苹果茎沟病毒和褪绿叶斑病毒分子变异研究[D];华中农业大学;2005年
9 姜秀云;牛分枝杆菌主要保护性抗原基因的克隆、表达及免疫研究[D];吉林农业大学;2005年
10 黄小波;猪传染性胃肠炎检测基因芯片与猪传染性胃肠炎病毒SC-H株N基因表达研究[D];四川农业大学;2006年
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1 陈雄艳;人IL-24基因的克隆、表达及活性鉴定[D];苏州大学;2004年
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3 丁彪;小鼠IFRG15基因在植入前胚胎及原核表达的研究[D];安徽农业大学;2010年
4 牟静;多头带绦虫四川株六钩蚴Tm45W基因的克隆与原核表达[D];四川农业大学;2010年
5 刘志强;抗Cyclin D1人源胞内单链抗体的原核表达与鉴定[D];吉林大学;2011年
6 王轶;甘蓝型油菜“蜀杂九号”防御素基因全长cDNA的克隆与原核表达[D];四川大学;2005年
7 张淑华;心肌型脂肪酸结合蛋白的原核表达与应用研究[D];吉林大学;2006年
8 王云珑;拟南芥Athspr突变体的耐热性分析及Athspr基因的原核表达[D];兰州大学;2010年
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10 欧阳锦凤;人博卡病毒结构蛋白VP1u,非结构蛋白ORFx和NP1的原核表达与抗体制备[D];华中师范大学;2011年
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