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《中国农业科学院》 2003年
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猪带绦虫六钩蚴cDNA表达文库的构建及免疫原基因的筛选、克隆与表达

景志忠  
【摘要】:猪囊尾蚴病(Cysticercosis cellulosae)是严重危害畜牧业生产和人类健康的人畜共患寄生虫病。猪带绦虫的生活史由成虫、六钩蚴和囊尾蚴三个发育阶段组成,六钩蚴是囊尾蚴的早期发育阶段,在入侵宿主及引起机体免疫学反应等方面扮演重要角色。本研究避开庞大的基因组DNA,以构建六钩蚴发育阶段的cDNA表达文库为切入点,从中筛选、克隆免疫原基因,并进行表达和功能分析。结果表明: 1.利用质粒表达载体pSPORT 1首次成功构建了猪带绦虫六钩蚴cDNA表达文库。经测定,库容量达5×10~6,重组率100%,用特异性引物能扩增出六钩蚴发育阶段10KD基因、18KD基因和45W基因家族的A型、B型、C型转录本,说明文库质量高,代表性强。 2.建立了筛选质粒表达文库和克隆免疫原基因的技术方法。应用该法成功地筛选和克隆到Ts01、Ts02、Ts03基因,其完整阅读框架(ORF)分别为393bp、1191bp和1818bp。其中将Ts01基因登录到GenBank,登录号为AY327451,经BLAST网站软件分析,证实是猪带绦虫六钩蚴发育阶段的一个新基因。实验表明,免疫学筛选基因的方法特异性强,灵敏度高,能快速地筛选大肠杆菌质粒表达文库,有利于大规模开展原创性研究。 3.用pGEX-4T-1表达载体和BL21寄主菌高效表达了Ts01基因的融合蛋白,并证实了该蛋白的免疫活性和稳定性。设计表达型特异性引物,将Ts01基因,亚克隆到pGEX-4T-1表达载体,构建pGEX-GST-Ts01的融合表达的重组载体,转化BL21寄主菌,IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE和Western蛋白分析,证实成功地获得了约40kD左右的融合蛋白质,与预测的分子量大小一致,表达量达到40%左右,具有免疫学活性,而且表达的产物呈可溶性,未形成包涵体,这与用蛋白质软件分析预测的Ts01编码蛋白为水溶性相一致。 4.利用生物信息学技术预测了Ts01基因及其编码蛋白的结构,为其功能研究鉴定了基础。TS01编码蛋白主要由谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、缬氨酸(V)等组成,含量高达8.5~16.9%;而脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)和酪氨酸(Y)含量较少,在0.8~5.4%之间;另外,不含色氨酸(W)。Ts01编码蛋白的结构与特性主要有:(1)TS01蛋白主要由α螺旋组成,占63.85%,β折叠很少仅占6.92%,除两个氨基酸的β折叠外,其余都集中在蛋白的后末端,经预测该蛋白具有亲水性(可能性为75.38%),是一个可溶性的非球形的蛋白质;(2)对蛋白结构特征分析,该蛋白无N端信号肽,C端包埋在分子的内部结构中,在第24位氨基酸与第25位氨基酸之间有一个蛋白酶位点,在第43位氨基酸开始有一个C2H2 type的锌指结构(CLACRLNFTNKSDYQVHRRLDH)的DNA结合位点;(3)对蛋白质转译后加工修饰预测,在氨基酸第2、54、68、69位有O-连糖基化位点,在第56位有一个酪氨酸的磷酸化位点,在68位有一丝氨酸的磷酸化位点。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S852.7

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