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《中国农业科学院》 2005年
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拟除虫菊酯降解菌株分离及生化分子基础研究

肖红利  
【摘要】:本试验从常州农药厂排污口所采的土壤样品中分离得到了一株生长快,菌落规则,传代稳定,降解能力较高的细菌菌株,并对其进行了生化、分子生物学基础研究,结果如下: 1.分离到的4-D菌株,根据Biolog试验和16S rDNA序列分析,初步鉴定为:Acinetobacter sP.(不动杆菌),该菌株在农药降解和微生物修复方面还未见正式报道。因此,4-9菌株为一株具有自主知识产权的拟除虫菊酯降解菌株,对该菌株及其相关性质的研究具有原创性。 该菌株为革兰氏阴性,能以拟除虫菊酯、有机磷等多种农药为唯一碳源,具有广谱性;生长温度范围较广,4℃、50℃时,菌株仍具有一定的生长能力。最适生长温度为28℃;DH7.0~9.0,测定OD_(600),没有明显变化,最适生长pH值为8.0;对农药的耐受浓度可以达到0.5g/L,最适生长的农药浓度为0.2g/L;4-D菌株与农药(0.2g/L)28℃、180rpm共培养24h时,对高效氯氰菊酯降解率为72.0%,三氟氯氰菊酯为46%,溴氰菊酯为46.3%,联苯菊酯为49.2%。共培养108h时,对高效氯氰菊酯降解率为76.5%,三氟氯氰菊酯为77.8%,溴氰菊酯为75%,联苯菊酯为70.3%。 2.初步分离纯化了高效氯氰菊酯降解酶,并对其酶学性质做了研究。结果表明:该降解酶属于组成型胞内酶,在pH值为6.0和11.0时,降解酶对高效氯氰菊酯的降解率均在45%左右,最适反应pH值为9.0;4℃与50℃温度条件下与高效氯氰菊酯保温8h,降解率在25%左右,最适反应温度为30℃;在最适反应温度和pH条件下,降解酶粗酶液与高效氯氰菊酯保温8h,其降解率为78%。 粗酶液经丙酮沉淀,Sephadex G-100凝胶层析和DEAE-52阴离子交换层析分离纯化。凝胶层析中降解酶的洗脱体积大约在70~90mL;DEAE-52阴离子交换层析中,降解酶存在于含500mmol/L NaCl的洗脱液中。SDS-PAGE电泳检测结果表明:最终纯化的降解酶为单一蛋白组分,其分子量约为55kDa。粗酶液对0.2g/L高效氯氰菊酯的降解速率为每毫克蛋白0.312nmol.min~(-1),经Sephadex G-100凝胶层析分离后降解速率为每毫克蛋白1.52nmol/L.min~(-1),DEAE-52阴离子交换层析分离后降解速率为每毫克蛋白10.8nmol/L.min~(-1)。最终的降解速率比分离纯化前提高了33倍。 3.构建了4-D菌株基因组文库,筛选到1株对高效氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯表现出良好的降解活性的重组菌株,提取重组质粒进行酶切鉴定,结果发现:插入的外源片段约5kb。对外源片段进行测序,将所得的部分序列登陆www.ncbi.nlm.nlh.gov网站进行比对分析。该基因片段与Rhs家族蛋白编码基因同源性达到59%。但Rhs家族蛋白是否与拟除虫菊酯农药的降解有关有待于更进一步的分析研究。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:X172

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