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《中国农业科学院》 2005年
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生物降解菌株Delftia tsuruhatensis AD9中染色体编码的苯胺代谢基因簇的克隆和功能研究

梁泉峰  
【摘要】:从印染厂活性污泥中分离到的一株能高效降解苯胺的细菌菌株AD9,其最高耐受苯胺浓度 为4500mg/l,在18小时内将起始浓度为1000mg/l的苯胺完全降解。经传统菌株表型比较、16S rDNA序列同源性比对(GenBank登录号:AY89912)、GC含量测定以及标准菌株DNA-DNA杂 交分析,将该菌鉴定为Delftia tsuruhatensis AD9。采用脉冲场电泳和Southern杂交实验结果表明, AD9的苯胺降解基因簇位于染色体上。本工作有关Delftia tsuruhatensis的苯胺降解能力以及苯胺 代谢基因簇的染色体定位特征研究属首次报道。 利用苯胺不完全降解时中间产物的显色反应如当邻苯二酚(Catechol)代谢被阻断时,邻苯 二酚累积后自身氧化成棕色;和2-羟粘康酸半醛(HMS)代谢被阻断或邻苯二酚双加氧酶过量表 达时,因HMS累积而呈现金黄色,建立了简便快速的苯胺代谢途径相关基因的功能筛选方法。 从构建的AD9的基因文库中筛选得到三个阳性克隆,分别为含9.3kb HindⅢ插入片段的棕色阳 性克隆pDA1、含大小为15.4kb的HindⅢ插入片段的金黄色阳性克隆pDBⅡ和含8.2kb EcoRⅠ 插入片段的金黄色阳性克隆pDB2。Clark-type电极测定重组子pDA1的苯胺双加氧酶酶活为32±3 mg O_2/(g dry、Wt).h;内源呼吸16±2 mg O_2/(g dry Wt).h。pDA1在含苯胺的LB液体培养基上培养 24小时后,GC/MS分析产物的化学性质:主要的特征离子在m/z 92(M+-H_2O),81(M+-CHO), 64(M+-H_2O,-CO),与邻苯二酚标准品的结果完全一致。比色法测定重组子pDB2的邻苯二酚 2,3双加氧酶(C23O)酶活为3.2 units/mg protein。 对三个阳性克隆pDA1、pDB2和 pDB11进行核苷酸序列分析,经拼接获得一段大小为24.7kb 的序列(GenBank登录号AY940090),包含25个开放阅读框,其中至少含有17个与苯胺代谢有 关的基因,命名为tad QTA1A2BRD1C1D2C2EFGIJKL。基因簇两侧含转座酶和IS1071序列。调控 基因tadR编码赖氨酸型调控蛋白。tadQTA1A2B基因簇的表达由一个启动子控制,编码多组分的 苯胺双加氧酶。tadD1C1D2C2EFGIJKL基因簇的表达由一个启动子控制,编码参与邻苯二酚间位 裂解途径所有的酶系,其中tadD1和tadD2编码的两组植物型铁氧化还原蛋白,tadC1和tadC2 编码的两组邻苯二酚双加氧酶,功能是催化邻苯二酚的开环反应。余下的tadEFGIJKL基因簇编 码2-羟粘康酸半醛脱氢酶(HMSD)、水解酶(HMSH)、2-酮-4-烯戊酸水解酶(OEH)、乙 醛脱氢酶(ADA)、4-羟基-2-酮戊酸醛缩酶(HOA)、4-草酰巴豆酸脱羧酶(OCD)和变构 酶(OCT)。将邻苯二酚开环所产生的中间代谢产物2-羟粘康酸半醛降解为丙酮酸和乙酰辅酶A。 AD9中苯胺降解基因紧密连锁成簇,两侧由转座酶基因(IS1071)序列环绕,具有典型的 基因岛(gene island)特征。AD9中苯胺代谢基因簇tad与Pseudomonas putida UCC22质粒编码 的苯胺代谢基因簇tdn在序列和遗传组织上有很高的同源性,进化上可能来自同一个祖先。序列 分析表明,tad基因簇是比tad基因簇更古老的基因型。AD9的tad基因簇两侧含有转座酶和IS1071 序列.有可能以基因岛为一个转座单元在不同微生物属或种间转移。在AD9苯胺代谢基因簇中 有5个功能尚不明确的开放阅读框,在模式菌P.putida UCC22苯胺代谢基因簇中没有发现,表 明基因岛作为一个转座单元在不同微生物属或种间转移的同时,可能还伴随着基因的转移或重 排,这也可能是污染环境降解微生物的生物多样性形成的一个重要原因。 构建了苯胺降解tad基因簇启动子-lacZ表达载体,β-半乳糖苷酶活性测定结果表明tad基 因簇的表达受苯胺诱导。苯胺双加氧酶基因拷贝数增加的重组菌AD91在苯胺浓度600mg/l的A15
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