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利用T-DNA插入突变和RNA干涉技术研究水稻基因功能

彭昊  
【摘要】:水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一,同时也是单子叶植物和禾谷类作物分子生物学研究的模式植物。目前水稻基因组序列测定工作已经基本完成,预测的编码基因超过40,000个。已测定的水稻全长cDNA克隆数目也已经超过32,000个。确定这些基因的功能将是今后研究的中心任务。鉴于根癌农杆菌介导的水稻遗传转化方法近年来日趋成熟,利用转基因的方法获得突变体被认为是水稻功能基因组学研究的主要途径之一。本研究利用T-DNA插入突变和RNA干涉技术创制水稻突变体,并根据突变体的表型来研究相应基因的功能和表达模式。 本研究是中国高技术研究发展计划项目“水稻突变体库的创制与功能基因组学研究”和国家自然科学基金项目“水稻受体激酶功能及其与环境信号分子的作用”的一部分,通过与合作者的共同努力,取得了以下主要研究进展: 建立了一套高效快速的根癌农杆菌介导的水稻遗传转化程序,从诱导成熟胚来源的愈伤组织开始,约90d后即可得到转化植株。获得潮霉素抗性愈伤组织的效率超过90%,由抗性愈伤组织分化再生植株的效率超过80%,PCR和Southern杂交检测表明大约95%的潮霉素抗性植株含有T-DNA插入片段。提高转化效率的关键在于降低共培养温度至19~22℃,并在选择培养10~15d后及时选择继代培养4~12d。利用上述程序构建了大规模的水稻增强子捕获突变体库。 评估了GAL4/VP16-UAS-GUS增强子捕获系统在水稻中的效率。对9,120株独立增强子捕获标签系的T_1代未成熟种子进行了GUS染色分析,观察并统计了胚,胚乳和种皮中GUS基因的表达频率。约40%的标签系在其中至少一个部位呈GUS阳性反应。从阳性标签系中随机挑选出212个样品,进行T_1代幼苗(根和叶)的GUS染色分析,约70%的样品在其中至少一个部位呈GUS阳性反应。利用PCR walking技术从这212个样品中分离扩增T-DNA插入位点的侧翼序列,共得到127条水稻基因组侧翼序列,并对T-DNA的插入位点和整合模式进行了详细的分析。根据插入位点的侧翼序列信息预测基因和启动子,并随机挑选了10个预测的启动子进行表达模式分析,有6个启动子表现出与原增强子捕获标签系相同的GUS表达模式。上述结果表明GAL4/VP16-UAS-GUS增强子捕获系统是一种分离水稻基因表达调控元件和研究水稻基因表达模式的有效方法。 利用T-DNA插入引入RNA干涉系统的方法,对一些预测的水稻类受体激酶基因进行功能分析。通过对RNA干涉植株的筛选,发现了1个新的与稻瘟病抗性相关的类受体激酶基因(RK41)。利用Southern和Northern杂交检测从T_0代RK41基因RNA干涉植株中筛选出了T-DNA为单拷贝插入且RK41基因表达量明显降低的株系用于进一步的分析。对该株系的T_1代RNA干涉植株和RK41基因的T_0代过量表达植株进行了RT-PCR检测,结果表明抑制RK41基因的表达后,水稻对稻瘟菌(Magnaporthe grisea)的敏感性增加,而过量表达RK41基因可以增强水稻对稻瘟病的抗性,即RK41基因的表达水平和水稻的稻瘟病抗性直接相关。


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