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《中国农业科学院》 2005年
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口蹄疫病毒免疫原基因在番茄和拟南芥中的表达及转基因番茄动物免疫试验

潘丽  
【摘要】:口蹄疫是当今世界上危害最严重的家畜传染病之一。疫苗接种是预防口蹄疫的主要措施。近年来,随着植物基因工程的发展,用转基因植物表达抗原相对于传统疫苗而言是一种更安全、更经济的表达系统。本研究将口蹄疫病毒免疫原基因整合进番茄基因组并得以表达,用转基因番茄叶片蛋白提取液经肌肉途径免疫豚鼠,根据豚鼠抗体水平的消长动态和免疫豚鼠抗强毒攻击的保护率进行植物疫苗免疫原性的研究,为FMD转基因疫苗的开发奠定基础。 此外,由于植物种子生产外源基因工程蛋白质的品质相当稳定,可作为饲料添加剂或口服疫苗,为优化表达体系,本研究构建了FMDV结构蛋白VP1基因的种子特异性表达载体。具体结果如下: 1)构建了O型FMDV China99株结构蛋白VP1基因的组成型植物双元表达载体pBin438/VP1及结构蛋白P1、非结构蛋白2A、3C以及部分2B基因的组成型植物双元表达载体pBin438/P12X3C。VP1基因及起始密码ATG、内质网引导多肽SEKDEL共660个核苷酸,编码220个氨基酸;P12X3C基因及起始密码ATG、内质网引导多肽SEKDEL共3018个核苷酸,编码1006个氨基酸,与亲本毒株相应核苷酸序列比较,同源性分别为100%和99.6%。 2)建立了番茄高频转化系统。高频转化系统以MS为基本培养基,附加ZT1.0mg/L和IAA0.1mg/L,选8~10日苗龄的子叶预培养2d,在活化的根癌农杆菌菌液里侵染3~5min,于暗处共培养2d后,直接在含卡那霉素再生培养基上筛选培养,形成抗性愈伤并分化出芽。转化率达18%。 3)转基因番茄PCR检测表明:FMDV免疫原基因VP1和P12X3C分别整合到番茄基因组中;RT-PCR结果证实目的基因在转基因番茄的转录水平表达;ELISA检测约40%的pBin438/VP1卡那抗性植株呈阳性,约25%的pBin438/P12X3C卡那抗性植株阳性:随机选取部分ELISA检测阳性植株进行Western blotting检测,重组蛋白能够与FMDV抗血清反应。表明FMDV免疫原基因VP1和P12X3C已分别转入番茄基因组并获得表达,且所表达的蛋白具有免疫反应性。 4)构建了FMDV结构蛋白VP1基因的种子特异性表达载体p7SBin438/VP1,浸花法转化拟南芥,分子检测表明,VP1基因已整合进拟南芥基因组并在荚中获得表达,为今后将FMDV免疫基因转入大豆等油料植物种子提供了实验依据。 5)转基因番茄叶片蛋白提取液免疫豚鼠,第一次免疫后10d ELISA检测不到FMD特异性抗体,第二次免疫后10d,豚鼠血清抗体水平显著提高并达到第一个高峰,第三次免疫后21d,抗体水平达到第二个高峰,其中pBin438/VP1转基因番茄第三次免疫豚鼠后21天血清效价最高可达1:64,攻毒后免疫豚鼠保护率达80%,pBin438/P12X3C转基因番茄第三次免疫后21天血清效价最高可达1:128,攻毒后免疫豚鼠保护率达100%。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:Q943.2;S852.4

【引证文献】
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1 王光华;独军政;薛慧文;常惠芸;;口蹄疫病毒重组蛋白表达及其亚单位疫苗研究进展[J];生物技术通报;2007年04期
2 王炜;张永光;王永录;方玉珍;潘丽;蒋守田;刘力宽;孙元;吕建亮;智晓莹;黄振华;;口蹄疫病毒亚洲I型YNBS/58株P12A-3C转基因植物双元表达载体的构建[J];中国人兽共患病学报;2006年11期
3 王炜;张永光;潘丽;王永录;方玉珍;蒋守田;张维德;吕建亮;孙元;智晓莹;黄振华;刘力宽;;口蹄疫病毒P12A-3C免疫原基因在百脉根中的遗传转化与表达[J];中国人兽共患病学报;2007年03期
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1 王炜;口蹄疫病毒P12A-3C基因在百脉根中的表达及其免疫豚鼠试验[D];中国农业科学院;2006年
2 孙元;Asia-Ⅰ型口蹄疫病毒P1-2A和3CD基因及IL-18基因重组腺病毒载体的构建[D];中国农业科学院;2006年
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【共引文献】
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5 东野传现;史玉颖;黄中利;刘玉山;亓丽红;傅剑;;“禽喘康颗粒冲剂”对鸡人工感染新城疫病毒临床效果的研究[J];山东农业科学;2007年02期
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10 李祥辉;黄大鹏;黄玉兰;;鸡抗小鹅瘟病毒IgY提取方法的比较试验[J];安徽农学通报(上半月刊);2009年23期
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2 樊荣辉;黄敏玲;钟淮钦;吴建设;林兵;叶秀仙;罗远华;;鹤望兰蓝色花相关基因克隆及表达分析[A];中国观赏园艺研究进展2011[C];2011年
3 庄金秋;梅建国;沈志强;;赤羽病病毒检测方法研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
4 庄金秋;梅建国;沈志强;;犬瘟热病毒实验室检测方法研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
5 蒋再学;陈征兵;林文;余邵华;竺薇;张晓明;罗满林;;仔猪伪狂犬PCR鉴定及病毒分离[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
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7 王珊;刘冰;李德朋;孙远;马勇;田秀丽;宋宇;王承宇;张乃生;;马蹄香治疗犬细小病毒性肠炎的疗效观察[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会第七届代表大会暨学术研讨会论文集(下册)[C];2011年
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8 徐伟荣;中国华东葡萄抗白粉病芪合成酶基因及启动子克隆与功能分析[D];西北农林科技大学;2010年
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10 熊义;IRES调控α-干扰素的抗FMDV研究[D];武汉大学;2009年
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1 刘红梅;农杆菌介导百子莲抗寒基因CBF1高效转化体系的建立[D];华中农业大学;2010年
2 周勇;草鱼出血病转基因植物疫苗表达载体的构建[D];华中农业大学;2010年
3 许媛媛;鸭瘟的动态病理学研究和鸭CD4的克隆[D];华中农业大学;2010年
4 刘冉冉;枫香遗传转化体系的优化及转化PaFT基因的研究[D];华中农业大学;2010年
5 曹玲;AM真菌孢子萌发及其与紫云英转化根双重培养体系建立的研究[D];华中农业大学;2009年
6 李爽;鸭源禽呼肠孤病毒感染雏鸭的免疫病理学研究[D];华中农业大学;2010年
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9 胡智斌;湖北省高致病性猪蓝耳病活疫苗(JXA1-R株)试用报告[D];华中农业大学;2010年
10 许莹;H3N8型马流感血凝素核酸疫苗的初步研究[D];南京医科大学;2010年
【同被引文献】
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1 张显升,赵启祖,刘在新,江鹏斐,常惠芸,陈应理,李冬,魏怀录,谢庆阁;口蹄疫病毒基因组内部核糖体进入位点一级和二级结构分析[J];病毒学报;2002年02期
2 郭慧琛,刘在新,孙世琪,冷青文,刘湘涛,谢庆阁;口蹄疫病毒多基因重组质粒的体外表达及衣壳组装[J];病毒学报;2005年03期
3 潘丽;张永光;王永录;王宝琴;王文秀;方玉珍;蒋守田;王炜;孙元;吕建亮;谢庆阁;;口蹄疫病毒结构蛋白P1-2A及蛋白酶3C基因的转基因番茄对豚鼠免疫反应的初步研究[J];病毒学报;2006年04期
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5 曹轶梅,卢曾军,刘在新,谢庆阁;口蹄疫自然感染动物与免疫动物鉴别诊断研究进展[J];动物医学进展;2003年06期
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1 曹轶梅;口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC的克隆及3AB基因在大肠杆菌中的表达[D];甘肃农业大学;2002年
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4 李文明;人α-乳清白蛋白基因植物表达载体的构建及其转基因可育番茄的获得[D];福建师范大学;2008年
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【二级引证文献】
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1 赵海明;孙桂枝;王学敏;刘贵波;;百脉根种质苗期抗旱性鉴定及综合评价[J];草原与草坪;2011年06期
2 马江涛;王宗礼;黄东光;吴燕民;;基因工程在牧草培育中的应用[J];草业学报;2010年06期
3 吴国华;张强;;口蹄疫转基因植物可饲疫苗研究进展[J];动物医学进展;2008年04期
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9 霍顺校;;分子生物学技术在我国畜禽疫病防治中的研究与应用[J];江西畜牧兽医杂志;2013年01期
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2 关宁;含硫氨基酸基因对烟草、百脉根的遗传转化及表达定位的研究[D];中国农业科学院;2009年
3 李玉珠;苜蓿与百脉根原生质体培养及体细胞杂交的研究[D];甘肃农业大学;2012年
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3 马江涛;抗逆转录因子基因的功能验证与转基因百脉根的获得[D];中国农业科学院;2011年
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7 潘丽;张永光;王永录;方玉珍;蒋守田;王炜;孙元;吕建亮;谢庆阁;;口蹄疫病毒转基因番茄对豚鼠诱导免疫保护[A];中国畜牧兽医学会2006学术年会论文集(下册)[C];2006年
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10 谢丽娟;转基因番茄的可见/近红外光谱快速无损检测方法[D];浙江大学;2009年
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3 白朋元;防龋用转基因番茄和生菜中目的基因遗传传递的初步分析[D];遵义医学院;2011年
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5 郭文文;转基因番茄对土壤生物学性质及养分吸收的影响[D];山东农业大学;2010年
6 韩琪;防龋用转基因番茄中外源目的蛋白表达稳定性研究[D];遵义医学院;2011年
7 郭芝光;葡萄白藜芦醇合酶基因的克隆及转基因番茄、酵母表达系统的建立[D];西北大学;2006年
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