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瘤胃微生物Real Time PCR定量方法的建立及其应用

赵玉华  
【摘要】:本研究分别以产甲烷菌、原虫和瘤胃细菌为例,根据其16S/18S rDNA序列、ITS序列和特有蛋白的基因序列,利用Real Time PCR技术,分别在种和类的水平上,建立了对瘤胃微生物绝对定量与相对定量的分子生物学方法,为瘤胃微生物的研究提供了一种快速、准确的方法。同时,应用此方法研究了植物油对瘤胃中产甲烷菌数量、氢化细菌数量及原虫数量的影响,探讨了植物油降低瘤胃微生物甲烷产量的途径。 DNA的提取采用珠磨——酚氯仿法。提取的瘤胃微生物总DNA在20Kb以上,OD_(260)nm/OD_(280nm)均在1.7~1.9,提取效率达87.64%。利用真细菌、古细菌和真菌16S/18S rDNA的通用引物从纯化后瘤胃微生物总DNA中成功扩增出目标条带,表明珠磨式机械破碎法能充分破碎包括细菌、真菌、原虫在内的各种瘤胃微生物,并满足后续实验的要求。 利用Acc Ⅰ、EcoR Ⅰ、Pst Ⅰ、Pvu Ⅱ、Sac Ⅰ、Sma Ⅰ等6种限制性内切酶将基因组酶切,通过Southern杂交确定M.formicicum的16S rDNA序列在基因组中有2个拷贝。设计了M.formicicum种专一探针,通过在GeneBank中用Blast进行比对,证实该探针特异性很高。对M.formicicum的Real Time PCR反应条件进行了优化,其最佳体系为:引物和探针的浓度分别为0.4μmol/L、0.2μmol/L,MgCl_2 4mmol/L,模板浓度为126ng。检测灵敏度可达到30拷贝/25μL体系。M.formicicum采用Real Time PCR方法测得的数量低于采用传统最大或然数法测得的数量,但两者之间具有很高的相关性(r=0.957,P0.01),说明采用Real Time PCR的方法能够如实的反映瘤胃微生物数量的变化。 以ITS为靶序列,采用SYBR Green Ⅰ荧光染料Real Time PCR法成功对M.mazei进行了定量检测,有效检测灵敏度可达300拷贝/25μL体系。同时,以微生物合成甲烷过程中的关键酶mcrA基因为靶基因,采用SYBR Green Ⅰ荧光染料Real Time PCR法,建立了瘤胃总产甲烷菌相对定量方法。利用上述方法,分别对肉牛、奶牛瘤胃中的M.formicicum、总产甲烷菌进行了检测,结果表明所测得的肉牛瘤胃中的M.formicicum、总产甲烷菌的数量远高于奶牛,这可能与肉牛日粮中粗料比例较高有关。同时,采用SYBR Green Ⅰ荧光染料Real Time PCR法成功对B.fibrivolen和R.ablus进行了定量检测。 日粮中添加4%棉籽油和4%豆油均降低人工瘤胃中微生物的甲烷产量,但二者之间无显著差异。不同时间段内,甲烷产量降低的幅度不同,其中采食后2~4h内甲烷产量降低的幅度最大,与对照组相比,分别降低25.52%和24.26%(P0.05),4~6h次之,6~8h变化最小。添加4%棉籽油和4%豆油,使人工瘤胃中的M.formicium、总产甲烷菌、Ciliate protozoa、B.fibrivolen和R.ablus的数量均减少。与对照组相比,添加4%棉籽油组和添加4%豆油组,7d中部采样M.formicium、总产甲烷菌、Ciliate protozoa、B.fibrivolen和R.ablus的数量分别减少了100%、100%,91.40%、82.57%,87.50%、96.87%,6.05%、12.94%,71.54%、89.43%,在底部采样中,分别降低了100%、100%,36.49%、40.54%,61.98%、67.55%,11.94%、14.74%,54.62%、43.10%。上述结果显示,植物油主要是通过杀灭瘤胃原虫,从而减少产甲烷菌数量以降低甲烷的生成。


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