Delftia tsuruhatensis AD9苯胺降解关键酶基因的功能鉴定和表达调节研究

【摘要】：苯胺是一种难降解、毒性大、可对生态环境和人类健康造成严重危害的典型有机污染物。苯胺降解菌株Delftia tsuruhatensis AD9分离自印染厂活性污泥,其最高耐受苯胺浓度为4500mg/l。以起始浓度1500mg/l苯胺为唯一碳源生长时,30小时达到最大生长量(OD_(600)=1.193;在以300mg/l邻苯二酚为唯一碳源生长时29小时达到最大生长量(OD_(600)=0.88)。采用氧化电极测定分子氧吸收率的方法,测定AD9的苯胺双加氧酶活性为82±6mgO_2g-dry-wt~(-1)h~(-1),而内源呼吸仅为30±6mgO_2g-dry-wt~(-1)h~(-1),表明AD9具有非常明显的苯胺双加氧酶活性。利用测定积累产物吸光值的方法,测定AD9的邻苯二酚2,3双加氧酶酶活为5.8u(mg crude protein)-1,而邻苯二酚1,2双加氧酶的活性仅为0.5u(mg crude protein)-1,表明AD9的苯胺代谢方式为间位裂解途径。 在克隆AD9完整的苯胺降解基因簇并完成核甘酸全序列测定(GENBANK登陆号AY940090)的基础上,本论文利用Fruitfly计算机软件分析和Blast序列比对,推测在AD9苯胺基因簇中可能存在着两个诱导型启动子和两个LysR型调控蛋白。第一个启动子位于苯胺降解基因簇前端,受LysR型调控蛋白TadR的调控,控制苯胺双加氧酶基因tadQTA1A2B和邻苯二酚双加氧酶基因tadC1的表达;第二个启动子位于基因orfS与tadD2之间,可能受OrfS的调控,控制基因簇中第二组邻苯二酚双加氧酶基因tadC2的表达。分析了两个启动子的转录起始位点、-10区和35区序列以及调控蛋白在启动子上的转录结合位点序列,预测其表达均为σ~(70)因子依赖型。预测了OrfS的三级结构,进行了序列比对及系统进化树分析。 为验证两个预测启动子的表达功能,采用载体pGD926和pPR9TT分别构建了两个预测启动子的lacZ融合性广宿主表达载体,分别命名为pGDP和pSDP。通过三亲接合方法将pGDP和pSDP导入AD9中,在不同底物诱导下测定了结合子的β-半乳糖苷酶活性,结果表明:AD9苯胺降解基因簇中第一个启动子的表达受到苯胺和对甲苯胺的诱导,第二个启动子的表达受到苯胺的降解中间产物—邻苯二酚的诱导和对甲苯胺的降解中间产物—4-甲基邻苯二酚的诱导。通过RT-PCR的方法验证了第一个操纵子和基因orfS的表达受到苯胺的诱导,第二个操纵子的表达受到苯胺和邻苯二酚的表达,并且邻苯二酚的诱导作用要高于苯胺的诱导作用。基于以上工作和相关文献推测了AD9降解基因簇的调控模式。有关苯胺降解基因簇中存在着两个诱导型启动子的研究在苯胺降解菌中属于首次报道,为AD9苯胺代谢调控分子机理的进一步研究奠定了理论基础。