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《中国农业科学院》 2006年
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里氏木霉RUT-C30甘露聚糖酶基因man1在毕赤酵母中的高效表达

陈小兵  
【摘要】:甘露聚糖类物质是自然界中半纤维素的第二大组分,分布广泛。β—甘露聚糖酶能水解底物生成甘露寡糖,释放出与之结合的水分、微量元素等。应用于猪、鸡、鸭和水产动物日粮,可提高饲料的利用效率,减少养殖业环境污染。甘露寡糖具有改善动物胃肠道微生态环境的功能。多种细菌、真菌、软体动物等分泌β—甘露聚糖酶,其基因属于糖基水解酶家族5。β—甘露聚糖酶在工农业生产和环境保护等方面有着广泛的用途。因此本研究的主要目的就是构建甘露聚糖酶的工程酵母来高效表达甘露聚糖酶,以解决目前甘露聚糖酶产量低、成本高等问题,同时也为生产甘露寡糖提供有效的解决途径。 本文利用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达甘露聚糖酶(mannanase)。首先将man1克隆到毕赤酵母穿梭表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-man1,经Sac Ⅰ线性化酶切,PEG将其整合到毕赤酵母GS115(His~-Mut~+)染色体上,利用MM、MD平板筛选His~+Mut~s型阳性克隆,在含不同浓度G418-YPD平板筛选高拷贝转化子。共筛选28株阳性克隆,将筛选到1株高拷贝菌株进行5L发酵罐优化表达研究,经测定蛋白分泌量达1.5mg/mL。表达产物经SDS-PAGE电泳分析,重组目标蛋白质量分数达到总蛋白的90%以上;相对分子质量为66KD,较理论设计值大,分析是因目标蛋白发生糖基化所致。该重组转化子RMAN23遗传稳定性良好。甘露聚糖酶活性测定结果为250IU/mL(刺槐豆胶为底物)和470IU/mL(魔芋为底物)。通过酶学性质研究该酶反应最适pH4.5,最适温度60℃。根据SDS-PAGE电泳和酶的功能分析,证明目的蛋白已在Pichia pastoris中成功实现表达,并且酶的表达量高于国内外文献的相关报道。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q786

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