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《中国农业科学院》 2006年
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催化合成茶氨酸的菌株筛选与重组菌的构建

王贤波  
【摘要】:茶氨酸(Theanine)是1950年首次从绿茶中分离得到的,是茶叶中的特征氨基酸,也是茶叶的呈味物质之一,具有很好的生理功能和商业价值。其制备研究是目前茶学研究中的一个热点。由于从茶叶中提取高纯度的茶氨酸,成本高昂;化学合成茶氨酸工艺较复杂;组织培养合成茶氨酸产量低。开展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理论意义和实践价值。本论文针对茶氨酸的微生物发酵法制备技术,开展了菌株筛选和工程菌构建两方面工作,将生物技术运用到天然产物制备技术中。本论文通过比较不同微生物催化L-谷氨酰胺(L-Gln)和盐酸乙胺合成茶氨酸的能力大小,对微生物进行了筛选,明确了9种微生物催化合成茶氨酸的能力;通过基因克隆技术构建了重组菌,优化了重组菌催化合成茶氨酸的条件,重组菌株酶活达到出发菌株的15倍,茶氨酸产量达到29.40g/L。主要研究结果如下: 1、对9种微生物催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺合成茶氨酸的能力进行了测试,发现它们催化合成茶氨酸的能力都很低。茶氨酸的最大生成量仅为7.9mg/L。 2、以培养好的Escherichia coli DH5α(E coli DH5α)菌液为模板进行PCR反应,将扩增出的γ-谷氨酰转肽酶基因片断和载体pET-32a相连接构建重组质粒pET-GGT,将重组质粒pET-GGT转化至E coli BL21中,构建重组菌。重组菌株经0.05mM IPTG在32℃诱导后,SDS-PAGE结果显示出明显的特征蛋白质条带。经酶活性检测,重组菌株每克湿茵体的酶活达到2.0U/ml左右,约是出发菌株E coli DH5α的15倍。 3、本实验优化了重组菌催化L-谷氨酰胺和盐酸乙胺合成茶氨酸的反应条件,重组菌经37℃培养2h左右,然后再加IPTG至0.05mM于32℃诱导表达4h收集菌体。1ml反应体系(含0.35ML—谷氨酰胺、2.0M盐酸乙胺、70mg/ml菌体、pH9.5)于30℃培养4小时,茶氨酸的最大生成量为29.40g/L,即每克湿菌体可催化合成茶氨酸的量为420g/L。L-Gln转化率为48.22%。Suzuki等报道的用构建的重组菌催化谷氨酰胺(Gln)和乙胺合成茶氨酸的量为20.90g/L,Gln转化率为6096。本实验中的L-Gln转化率稍低,但是茶氨酸产量有所提高。 本实验构建的重组菌具有较好的催化L—谷氨酰胺和盐酸乙胺合成茶氨酸的能力,可以尝试用其进行发酵生产茶氨酸小试实验,可以尝试将本实验构建的重组质粒转化到不同表达载体系统中,以寻找更适合γ-谷氨酰转肽酶大量表达的载体系统。本实验对于微生物发酵法工业化生产茶氨酸等方面的工作具有较好的指导作用和实际价值。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:TQ920;Q78

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