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《中国农业科学院》 2006年
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芽孢杆菌β-甘露聚糖酶新基因的快速筛选、克隆及表达研究

李雅楠  
【摘要】:β-甘露聚糖酶(β-Mannanase)是一类能水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露多糖的内切水解酶,属于半纤维素酶类,主要来源于微生物,植物和低等动物中。β-甘露聚糖酶在造纸,食品,饲料,制药和石油开采等很多方面有重要的应用价值。微生物则是产β-甘露聚糖酶的重要来源,微生物来源的β-甘露聚糖酶具有产量高、易控制和成本低等优点。 芽孢杆菌是β-甘露聚糖酶的重要来源,具有较大的工业应用价值。本研究通过对核苷酸序列的比较,设计了一对简并引物,利用PCR技术,建立了一种快速的筛选芽孢杆菌新的β-甘露聚糖酶编码基因的方法。这种方法不仅可以快速评估所获得的基因片段的新颖性,而且通过反向PCR等方法可以克隆到基因的全长序列。利用此方法,从16株产β-甘露聚糖酶芽胞杆菌中,分别克隆了其β-甘露聚糖酶的部分基因片段。通过序列比对分析,其中两个基因片段同已发表的β-甘露聚糖酶基因相似性较低。通过反向PCR得到了两个基因的全长序列,分别命名为manB48和manB49。Genbank注册号为AY907668和AY913796。这两个基因同已发表的甘露聚糖酶基因序列的最高相似性分别为62.3%和62.4%。通过同源克隆获得另外一个β-甘露聚糖酶基因manB36,Genbank注册号为DQ351940。以上实验结果证实了这种快速筛选新基因方法的有效性。 来源于环形芽孢杆菌B48的甘露聚糖酶编码基因manB48在大肠杆菌和毕氏酵母中都得到了表达。通过亲和层析,纯化了在大肠杆菌中表达的融合蛋白MANB48E-H,并分析其酶学性质。MANB48E-H的最适pH和最适温度分别为7.6和58℃;有较好的pH稳定性,在pH6.8~9.0范围内酶活性维持在75%以上;MANB48的比活为481.55U/mg。 另一个来源于环形芽孢杆菌的新的甘露聚糖酶编码基因manB49同样在大肠杆菌和毕氏酵母中得到了表达。通过亲和层析,纯化了在大肠杆菌中表达的融合蛋白MANB49E-H。MANB49E-H的最适pH和最适温度分别为7.6和60℃;MANB49在pH6.0~10.0之间较稳定,剩余酶活性在75%以上,在pH11.0时,仍有28.68%的酶活性,这说明此酶具有很好的pH稳定性。MANB49E-H的比活为2276.81U/mg,是MANB48E-H比活的4.8倍。 从枯草芽孢杆菌B36培养液中纯化了β-甘露聚糖酶MANB36。MANB36的最适pH和最适温度分别为5.6和50℃。60℃下处理60分钟,MANB36保持了90%的酶活性;MANB36的比活为927.84U/mg。金属离子(除了Hg~(2+)和Ag~+),EDTA和2-ME对酶活性均无明显影响;MANB36对底物角豆胶有较高的特异性。 MANB36的编码基因manB36分别在大肠杆菌和毕氏酵母中得到表达,并纯化了酵母表达的融合蛋白MANB36P。MANB36P的最适pH和最适温度为6.2和42℃。同原酶相比,MANB36P的耐热性和pH稳定性均有所降低 本实验初步建立了一种新基冈的快速筛选方法,利用此方法筛选了三个β-甘露聚糖酶基因并做了进一步的研究。本实验为对新的β-甘露聚糖酶的研究提供了新的思路和经验。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q78

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