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《中国农业科学院》 2006年
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日本血吸虫丝/苏氨酸蛋白磷酸酶新基因SjPP的研究

姚利晓  
【摘要】:日本血吸虫病是我国一种危害严重的人畜共患寄生虫病。东方田鼠是迄今在疫区发现的唯一一种感染血吸虫后不致病的哺乳类动物,免疫机理研究表明东方田鼠血清中的IgG抗体,特别是IgG_3在杀伤日本血吸虫中具有重要作用。本课题组曾利用东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,寻找与东方田鼠抗病相关的血吸虫靶抗原编码基因。本论文从免疫筛库获得的5个EST序列中,选择丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因进行了深入研究。丝/苏氨酸蛋白磷酸酶可逆转蛋白激酶的作用过程,在蛋白质的可逆磷酸化调节过程中具有重要作用。至今,对日本血吸虫丝/苏氨酸蛋白磷酸酶的研究仍鲜有报道。 1.根据EST序列,利用5′RACE技术首次克隆获得日本血吸虫丝/苏氨酸蛋白磷酸酶新基因SjPP(GenBank登录号AY902477)。该基因的ORF含906bp,编码302个氨基酸,理论分子量34.7kD,理论等电点5.51。生物信息学分析表明SjPP基因的编码蛋白具有丝/苏氨酸蛋白磷酸酶的特征模块GDXHGQ、GDXVDRG和RGNHE及特异性抑制剂冈田酸的结合位点SAPNYC,与PP2A亚家族蛋白PP6(72%)、PPV(71%)、PPE1(63%)、SIT4p(61%)、PP4C(59%)具有高度同源性。荧光定量PCR分析显示SjPP基因在血吸虫童虫和成虫中都有表达,表达量由高到低依次为31d成虫、44d雌虫、44d雄虫、14d童虫和7d童虫。 2.首次构建SjPP的原核重组表达质粒pET28a(+)-SjPP和核酸疫苗pCMV-SjPP,并对其免疫保护功能和免疫保护机制进行研究。 2.1 含有pET28a(+)-SjPP的大肠杆菌BL21(DE3)在0.1mM IPTG诱导2h时,每克菌体产生约18mg以包涵体形式存在的重组蛋白rSjPP,Western-blot分析结果表明rSjPP具有良好的抗原性。ELISA结果显示rSjPP蛋白能被东方田鼠血清IgG、特别是IgG_3很好地识别,可能是东方田鼠体液免疫作用的靶标之一。 2.2 酶学分析结果显示,纯化并经透析复性的rSjPP具有丝/苏氨酸蛋白磷酸酶活性,最适反应pH为8.0,最适作用温度为60℃,1~4mM Ni~(2+)可增进rSjPP酶活性。 2.3rSjPP蛋白免疫BALB/c小鼠和昆明系小鼠后产生了高滴度的特异性IgG抗体,分别诱导产生了18.2%和17.8%的减虫率、15.4%和40.8%的肝组织减卵率和32.2%的粪便减卵率(BALB/c小鼠)。酶学分析显示免疫组小鼠体内血吸虫的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶活性几乎完全被抑制(抑制率95%)。显示小鼠血清中特异性抗rSjPP抗体IgG对日本血吸虫体内SjPP蛋白发生作用,可能是诱导宿主产生减虫效果和明显的减卵效果的机制之一。从一个侧面揭示了东方田鼠血清中IgG抗体抗血吸虫的可能作用机理。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S852.7

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