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《中国农业科学院》 2007年
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AsiaⅠ型口蹄疫病毒空衣壳抗原的表达与免疫研究

李志勇  
【摘要】: FMD是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。2005年在我国数省区爆发的AsiaⅠ型FMD对国家造成了巨大的经济损失。然而AsiaⅠ型FMDV研究资料相对较少,不利于防控工作的开展。因此本研究选用AsiaⅠ/JQ株为研究材料,对其编码区序列进行了测定,并借助计算机软件进行了生物信息学分析。在此基础上,利用家蚕杆状病毒表达系统表达了空衣壳抗原,并对表达产物进行了免疫效力评估。 (1)FMDV AsiaⅠ/JQ株的编码区序列测定:通过RT-PCR方法获得了AsiaⅠ/JQ株的编码区序列,并应用DNAStar软件进行了生物信息学分析。通过与国内外典型代表毒株进行比较与分析,结果显示该毒株结构蛋白编码区与AisaⅠ型参考毒株同一区域同源性较高,而非结构蛋白编码区L、P2、P3却与O型参考毒株同一区域同源性较高。从利用P1蛋白编码区绘制的系统进化树分析,AsiaⅠ/JQ株与起源于印度的两株AsiaⅠ型病毒遗传距离较近,而利用非编码区绘制的系统进化树却表明与O型的两株病毒遗传距离较近。据此推测该毒株为一株O型与AsiaⅠ型FMDV的重组毒株。 (2)运用Garnier-Robson方法、Chou-Farplus方法和Karplus-Schulz方法预测了AsiaⅠ/JQ株FMDV结构蛋白的二级结构。运用Kyte-Doolittle方法对结构蛋白的亲水性进行分析,用Emini方法预测结构蛋白的表面可及性,以Jameson-Wolf方法预测了结构蛋白的抗原指数。然后综合评价了AsiaⅠ/JQ株结构蛋白的B淋巴细胞表位。结果表明VP1、VP2、VP3三个结构蛋白上存在较多潜在的B细胞表位,VP4上也存在着少量的抗原表位。这一结果提示在设计FMDV基因工程疫苗时应予以综合考虑,不应局限于VP1蛋白。 (3)将AsiaⅠ/JQ株全长6.9Kb的ORF克隆到家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组家蚕杆状病毒转移质粒pVL-ORF。pVL-ORF与线性化的亲本病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞,经空斑筛选后成功获得了携带有FMDV全长ORF的重组病rBmNPV(ORF)。通过免疫荧光技术证明重组病毒能够正确表达插入的外源基因。将获得的重组病毒rBmNPV(ORF)感染家蚕5龄起幼虫,通过双抗体夹心ELISA法和电镜观察证明目的基因在蚕体中获得较高水平表达并组装成空衣壳。用蚕表达产物作抗原制备疫苗免疫牛,免疫动物均产生了特异性抗体。免疫后21天进行病毒攻击保护试验,获得了2/4的保护率。 (4)采用类似的方法构建了包括AsiaⅠ/JQ株P1-2A和3C基因的重组病毒rBmNPV(P1-2A3C)。通过免疫荧光技术证明重组病毒能够正确表达插入的外源基因。双抗体ELISA法测定目的蛋白在蚕体上获得了极高的表达量。通过电子显微镜技术,在蚕血淋巴中观测到大量的病毒空衣壳。将表达产物制备成疫苗一次免疫牛后,实验动物产生了针对FMDV的特异性抗体。28天后使用10,000BID_(50)同源强毒攻击,获得了4/5的保护率。 (5)参照OIE规定的PD_(50)测定法进行了rBmNPV(P1-2A3C)表达产物的免疫效力实验。结果显示以稀释40倍抗原制备的疫苗其PD_(50)值为3.60,以稀释30倍的抗原制备的疫苗其PD_(50)值为6.34。这一结果为利用家蚕杆状病毒生产的空衣壳疫苗最终走向市场奠定了良好的前期工作基础。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S852.5

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前3条
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【同被引文献】
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【相似文献】
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7 记者 范建;坐在家中“网”天下农业新鲜事[N];科技日报;2005年
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