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水稻T-DNA插入黄叶突变体基因克隆与功能分析

陈青  
【摘要】: 叶绿体的正常发育需要控制叶片发育及编码叶绿体蛋白的核基因与编码自身蛋白的叶绿体基因之间的相互协调。这些基因的突变将导致叶绿体发育的缺陷、叶绿素合成减少,叶色变异等。作为一种易于观察的性状突变,叶色突变体是研究光合系统结构、功能及其调控机制的理想材料。本研究以转绿型水稻T-DNA插入黄叶突变体vyl(virescent yellow leaf,vyl)为材料,研究了其遗传规律、光合特性、突变基因及其功能,从植物生理和分子水平上初步阐明了vyl突变体的突变机理,为vyl突变体在水稻光合生理、功能基因组学研究和生产等方面的利用提供了理论依据。另外,本研究还对水稻T-DNA插入黄叶突变体yl(yellow leaf,yl)在不同光照条件下的光系统Ⅱ光化学活性与色素组成进行了分析,明确了光照强度对其光合特性的影响,为探讨yl突变体的突变机理及其应用奠定了基础。主要研究结果如下: 1.vyl突变体鉴定与遗传分析表明,vyl突变体为单隐性核基因控制的T-DNA插入突变体,且只有一个T-DNA插入拷贝。其未展开叶呈乳黄色,叶片展开后叶色从叶尖向叶基部开始转绿,但完全转绿的叶片仍比野生型浅绿。vyl突变体的这种表型在整个叶片生长发育期间保持稳定不变。vyl突变体植株较野生型矮小,能正常生长和结实,是国内外尚未报道的一种新型水稻叶色突变体。 2.vyl突变体的光合特性研究结果表明,vyl突变体是一个叶绿素b减少型突变体,其倒二叶叶绿素a、叶绿素b、β-内胡萝卜素和总叶绿素含量均显著低于野生型,但其叶绿素a/b比值高于野生型;随着叶片的发育,其叶绿体发育较野生型显著滞后。2d野生型倒二叶的叶绿体已发育成熟(以心叶生长出的第一天为0d),有一个完整的内囊体膜体系,叶绿体结构完整,基粒片层丰富,而对应vyl突变体叶片的叶绿体基粒垛叠减少,即使12d完全转绿的vyl突变体倒二叶叶绿体,基粒片层仍明显少于2d野生型。虽然vyl突变体的光合系统Ⅱ(PSⅡ)的最大光化学效率与野生型之间无明显差异,但其PSⅡ的事实光化学效率(φPSⅡ)、电子传递速率(ETR)、光化学猝灭系数(qP)和非光化学猝灭系数(qN)较野生型显著减少,表明其光合系统Ⅱ(PSⅡ)的供体侧和受体侧的光化学活性均受到了严重抑制;vyl突变体光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心蛋白CP43,CP47,D1,D2和LHCⅡ蛋白较野生型显著减少,更多的叶绿素参与其光系统Ⅰ(PSⅠ)色素蛋白复合体的形成。 3.采用PCR-Walking方法,从vyl突变体植株中获得了T-DNA插入位点的右翼序列,对右翼序列进行blast比对及T-DNA插入与表型的共分离验证,获得vyl突变体候选基因VYL,确定VYL位于水稻第9染色体,T-DNA插在其第一个外显子起始密码子下游64bp处。根据VYL的ORF及其EST序列设计特异引物进行RT-PCR扩增,获得了VYL全长cDNA。经转基因功能互补验证,确定VYL为vyl突变体目的基因。VYL是一个新的叶色突变基因,具有一含有锌指结构的精氨酸甲基转移酶互作蛋白功能域AIR1。在水稻中,AIR1主要存在于基因编码产物分别为锌指蛋白、逆转座子、反转录元件类似蛋白和一种假定蛋白4类基因中,具有翻译后修饰的功能,在调节核基因的表达和信号传导中也具有重要作用;VYL基因在根中表达较弱,在叶中表达较强,在茎中的表达中等;除了在2d未展开的倒二叶中表达稍弱外(以心叶生长出的第一天为0d),VYL基因在4d、6d、8d和12d倒二叶中均较强表达,说明VYL基因不存在时空表达特异性。采用GFP标签技术和基因枪转化法将VYL基因转入洋葱表皮细胞,将VYL基因定位在细胞质中,这与AIR1具有翻译后修饰的功能一致。 4.yl突变体是一个叶绿素b减少型的突变体,在整个生长发育期间始终表现为浅黄色的叶色表型,其叶绿体类囊体膜和基粒片层较野生型显著减少。在微弱的光照条件下(50μmol photons m~(-2)s~(-1),其色素含量、事实光化学效率(φPSⅡ)、光化学淬灭(qP)和光下开放的反应中心捕获的激发能效率(Fv'/Fm')显著低于野生型,但其Chl a/b比值远远高于野生型。随着光照强度的增加,其总叶绿素含量、φPSⅡ、qP和Fv'/Fm'增加,Chl a/b比值、单位色素的光吸收强度下降,(Z+A)/(V+A+Z)比值伴随着非光化学淬灭(qN)的显著增加而显著增加。yl突变体较野生型发育迟缓与其光能利用率低有关,而与光照强度无关。yl突变体主要采用叶黄素循环淬灭多余的激发能而免受光抑制的伤害。


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