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鸡贫血病毒结构蛋白抗原表位研究及感染性克隆构建

王晓艳  
【摘要】: 为了研究鸡贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)VPI蛋白的抗原表位,本研究根据生物软件Lasergene对VP1蛋白抗原性的分析结果,将VP1蛋白进行了分段表达,选取缺失VP1 N端68个氨基酸的融合表达产物VP1-A进行纯化,免疫BALB/c鼠,制备了6株抗VP1蛋白的单克隆抗体(MAb)。以这些MAbs对分段表达的VP1蛋白进行Western blot分析,在VP1蛋白上初步鉴定出3个抗原位点,分别位于VP1的219-274氨基酸(aa)残基、324-369aa和275-302aa残基内。 为了更详细而全面地了解VP1蛋白的抗原结构,构建了vp1基因特异性噬菌体展示肽库,利用多克隆抗体对肽库进行3轮淘选,得到9个阳性噬菌体。序列分析表明,有5个克隆展示有相同的序列“T~(309)YMSFATLTALGAQWSFPPGQRSVSRRSFNHHKARG~(344)”,有4个克隆展示有相同的序列“M~(196)FGGWHLFRHIETRFQLLA~(214)”。利用制备的6株MAbs与这些阳性噬菌体进行Western blot分析,结果表明2F3等4株MAbs与噬菌体P12反应。为了对这4株MAbs及MAb 4D5对应的表位精确定位,人工合成一系列成对的寡核苷酸,退火后插入pET32a载体中进行融合表达。利用MAbs对融合蛋白进行Western blot反应性扫描,鉴定出2F3等4株MAbs对应的表位位于D~(245)HQNRWRKG~(253)。利用同样的方法鉴定出MAb 4D5对应的表位位于W~(353)HTLVPLGTE~(362)。 根据生物软件Lasergene对VP2蛋白的分析发现该蛋白具有良好的抗原性,为了对其进行表位作图(epitope mapping),首先在E.coli中克隆、表达了VP2蛋白全长,纯化后免疫BALB/c鼠,制备了7株抗VP2蛋白的单克隆抗体。人工合成一套彼此重叠6个氨基酸长度为16个氨基酸并覆盖VP2全长的短肽,融合表达后与MAbs进行Western blot和ELISA反应性扫描,鉴定出3个抗原表位,分别为G~(21)QPGPSGAAQGQVISN~(36),L~(111)EDRSTQASLEEAILR~(126)和E~(121)EAILRPLRVQGKRAK~(136),而G~(16)AAQ~(20),Q~(117)ASL~(120)和P~(127)LRV~(130)分别为各表位的的主要功能区。用这3个纯化后的融合短肽免疫BALB/c鼠,结果表明这些融合蛋白均能诱导小鼠产生VP2蛋白的特异性抗体。 为了研究vp3基因对病毒复制及致病力的影响,构建了CAV的感染性克隆及vp3完全缺失(pBluem2CAVVP3~-)和NLS2缺失(pBluem2CAVNLS2~-)的两个突变体。首先构建了含有CAV双拷贝基因组顺向串联的重组子,转染MDCC-MSB1细胞,获得了能够自我复制的CAV,体内试验显示该质粒注入鸡体内,可以引起与CAV感染相似的病理变化。又对vp3基因及vp3基因C端的核定位信号(Nuclear location signal NLS)进行缺失,分别构建了带有缺失的突变体pBluem2CAVVP3~-和pBluem2CAVNLS2~-,转染MDCC-MSB1细胞,初步证实vp3基因缺失后在体内体外均检测不到病毒复制,但vp3 C端NLS2缺失后在体外可以检测到病毒复制,而体内试验结果显示NLS2缺失的突变体可以引起鸡胸腺小体数目增多等变化。CAV感染性克隆的构建为获得纯化的病毒及研制新型疫苗奠定了基础,两个vp3基因突变体的构建为研究vp3基因功能及获得毒力减弱的病毒奠定了基础。


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