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《中国农业科学院》 2007年
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花生短肽制备及其功能活性研究

张宇昊  
【摘要】: 对酶解过程中各种影响因素进行了系统研究,通过正交旋转组合建立了短肽得率及水解度与各种影响因素的回归模型;在此基础上,选用Alcalase作为花生蛋白酶解工具酶,结合实际生产确定出了Alcalase酶解花生蛋白的最适参数组合为水解温度53℃,底物浓度4%,酶用量3637U/g,水解时间105min,pH 8.0。在此条件作用下,花生短肽得率为80.35%,水解度为17.72%。 在花生蛋白Alclase水解的研究基础上,对影响复合酶解过程中各种影响因素进行了系统研究,通过均匀设计建立了短肽得率与各种影响因素的回归模型;基于以上研究,选用N120P为复合酶解的工具酶,确定了N120P继续Alcalase酶解花生蛋白的最适参数组合为水解时间65min,水解温度57℃,酶底比2061U/g,pH 6.0。最终花生短肽得率为89.01%,水解度为23.76%。 在以上研究基础上,对花生蛋白酶解动力学进行研究。建立了Alcalase酶解动力学模型:R=254.65E_0exp[-0.3352(DH)],动力学常数a=254.65E_0/S_0,b=0.3352,K_2=254.65 min~(-1),酶失活常数为84.777min~(-1);得到N120P继续Alcalase酶解动力学模型为R=(9.46563E_0+0.14519)exp[-0.2629(DH)],动力学常数a=9.46563e_0/S_0+0.14519,b=0.2629,K_2=9.46563 min~(-1),酶失活常数为2.60511 min~(-1)。 建立了阴阳离子混合床脱盐法,确定了短肽脱盐最适参数组合为:水解液过柱速度为5~10倍柱体积/h、水解液pH值4.5、阴阳离子树脂比例为3:2,在此条件下花生短肽脱盐率和回收率均大于80%,效果优于传统脱盐方法;指标测定结果表明,脱盐花生肽纯度达到90.25%,分子量主要分布在126~949Da之间,游离氨基酸含量为66.4mg/g。 采用超滤技术对花生短肽进行分离,确定了一级超滤最适操作条件为操作压力0.18MPa、料液浓度5%~7.5%、操作温度35℃;二级超滤最适操作条件为操作压力0.21MPa、料液浓度7.5%、操作温度40℃。超滤后分子量小于1KD的花生短肽总得率为25.02%。 利用体外化学模型证明了花生短肽具有抗氧化和ACE抑制活性,其中ACE抑制活性非常突出,IC_(50)值为0.517mg/ml;脱盐可以增强花生肽的ACE抑制活性,超滤则可富集ACE抑制活性肽段,其中分子量小于1KD的花生短肽的ACE抑制IC_(50)值为0.255 mg/ml。 通过机理研究证明了分子量小于1KD的花生短肽对ACE的抑制属于竞争性抑制且对消化酶的水解具有一定的抗性;动物实验研究结果表明分子量小于1KD的花生短肽可显著降低原发性高血压大鼠的尾动脉收缩压(p0.05),对原发性高血压大鼠的心率无影响,降压作用平稳,不会因服用剂量偏差而造成低血压现象,且可被完整吸收进入血液循环进。 通过散点图和非线性回归模型,证明了蛋白质中侧链不带电的极性氨基酸、碱性氨基酸和酸性氨基酸含量对蛋白质水解物ACE抑制活性无明显影响;疏水氨基酸、芳香族氨基酸和支链氨基酸含量高的蛋白质更适合作为酶法生产ACE抑制肽的原料。 基于以上研究,对花生短肽制备工艺参数进行放大,放大实验发现,需采用截流分子量为150Da的纳滤对花生蛋白酶解液进行预脱盐,纳滤过程中样品稀释倍数为10倍时可有效提高混合床脱盐效率;放大实验最终得到短肽产品纯度均大于85%;总得率为28.4%,其中小于1KD短肽ACE抑制IC_(50)值为0.237mg/ml,证明花生短肽制备工艺可以应用到花生短肽产业化中。
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