收藏本站
《中国农业科学院》 2007年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

猪囊尾蚴dUTPase的表达、活性分析及结构预测

刘振勇  
【摘要】: 猪囊尾蚴病(Cysticercosis cellulosae)是由猪带绦虫(Taenia solium)的幼虫猪囊尾蚴(Cysticercus cellulose)所引起的一种人畜共患病。该病广泛存在于发展中国家,不仅严重影响养猪业的发展,造成巨大的经济损失,而且还威胁着人类身体健康。因此,1993年世界卫生组织将猪囊尾蚴病列为需要根除的六大疾病之一。目前,囊虫病的防治以疫苗免疫和药物治疗为主,但普遍存在疫苗保护力不够、药物的毒副作用太大等缺点,所以新型疫苗和药物的研制一直是人们关注的焦点。dUTP焦磷酸酶(dUTPase)是一种重要的DNA复制修饰酶,广泛存在于各种生物有机体中,可特异性水解dUTP产生dUMP和PPi,防止DNA复制过程中dUTP浓度过高而引起的错误掺入,提高了DNA复制的精确性。近年来dUTPase作为一种新的药物靶蛋白越来越受到人们的重视,许多病毒、细菌和寄生虫的dUTPase晶体结构被解析,研究dUTPase在抗囊尾蚴病中的作用,为dUTPase的药物设计和开发提供了有力的支持。 本实验首次成功克隆出猪囊尾蚴dUTPase(Cysticercus cellulose dUTPase,CY dUTPase)基因,测序结果显示与已知的猪带绦虫六钩蚴dUTPase基因的核苷酸同源性为100%。为进一步研究CY dUTPase的生物学功能,将其与pET28载体连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了大量表达,表达产物主要以可溶性形式存在。同时将pET28空载体进行相同的表达纯化对照实验,重组表达菌液的超声上清经镍琼脂糖凝胶纯化后进行SDS-PAGE检测,结果只是在重组猪囊尾蚴dUTPase菌液上清中出现21KD大小的特异性条带,这说明本实验表达纯化的CY dUTPase中完全排除了宿主dUTPase的污染。dUTPase催化底物(dUTP)生成dUMP和焦磷酸(PPi),PPi与钼酸铵形成的复合物在575nm有特定的光吸收值,测定575nm的OD值就能计算出PPi的量。在CY dUTPase的催化反应中,通过测定产物PPi单位时间的生成量来计算底物的消耗量,以此计算酶的催化活力。结果显示重组dUTPase每分钟水解1nmol dUTP所需的酶量为21.3095μg,纯化的dUTPase 1个酶活力单位为21.3095μg;酶的比活力为46.929U/mg。在酶促反应体系中加入不同金属离子或EDTA后测定dUTPase活力的变化,结果EDTA可以抑制CY dUTPase的活性;而金属离子可以增强酶的活性。同时金属离子还可以恢复被EDTA抑制的dUTPase的活性,其中以Zn~(2+)的恢复效果最明显,可以使dUTPase的活性恢复99.65%。在所测定的四种金属离子中,Mg~(2+)对dUTPase活性的增强作用最明显。 为进一步研究CY dUTPase结构和功能的关系,用SWISS-MODEL直接构建了CY dUTPase的3D模型,通过WHAT IF、ProSac程序对模型进行立体化学结构、能量分布的质量评估,模型评估的得分结果表明所建模型结构合理。CASTp程序的口袋分析显示CY dUTPase共有27个活性口袋,其中第26号口袋主要由CY dUTPase的β-发夹构成,该发夹结构是大多数已知晶体结构的三聚体dUTPase活性口袋的重要组成部分,表明CY dUTPase可能与其它三聚体dUTPase具有同样的催化机制。CY dUTPase C端的Gly富集区(Gly-X-Gly-X-X-Gly),Ala(83)和Tyr(90)等这些关键氨基酸与其它三聚体dUTPase(Human dUTPase)高度保守,这些氨基酸不仅能维持口袋区正常的空间结构,同时也在酶与底物的识别中起决定性作用。通过对不同类型dUTPase晶体结构的分析,推测CY dUTPase属于同源三聚体。用SymmDock程序预测了CY dUTPase的四级结构,该结构显示CY dUTPase的活性区是由3个亚基各自的β-发夹、α-螺旋和C端环肽链共同组成,这与大多数三聚体dUTPase的催化活性区结构相一致。将CY dUTPase的四级结构与已知三聚体dUTPase的晶体结构进行叠合,结果显示两者能很好的吻合,证明构建的CY dUTPase四级结构合理。成功构建的CY dUTPase 3D模型为抗囊虫药物的设计和开发提供了一个良好的研究模型。 通过在线服务器设计CY dUTPase的siRNA靶位点,针对靶序列设计shDNA(short hairpin DNA)时,在其3’端引入一段与鼠U6启动子3’端同源互补序列,5’端则加入一段下游通用引物,设计好的shDNA由IDT公司合成。从鼠的肌肉中提取基因组并扩增出U6启动子序列,将U6启动子和shDNA一起退火延伸,分别用U6启动子的上游引物和shDNA的下游引物进行PCR,采用重叠延伸一步法制备CY dUTPase的siRNA表达盒(siRNA expression cassettes,SECs)。选取猪囊尾蚴肌动蛋白基因(clone pAT5 actin)作为内参照,建立了CYdUTPase基因半定量RT-PCR的检测方法。CY dUTPase干涉表盒的制备和半定量RT-PCR的检测方法的建立,为CY dUTPase基因RNAi的研究奠定了基础,同时也为囊虫病反义药物的研制提供了理论依据。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S852.7

手机知网App
【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 王路;长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的原核、真核表达及其结构的预测[D];甘肃农业大学;2008年
2 贾志磊;急性病毒性坏死病毒dUTPase基因的克隆及表达分析[D];中国海洋大学;2012年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 郝建华,徐霞,吴俊英,田维铨,李志军;单克隆抗体酶免疫法测定脑囊虫病循环抗原及其评价[J];蚌埠医学院学报;1994年01期
2 阎玉河,邵一鸣,潘品良,贾斌,沈荣显;马传染性贫血病毒强、弱毒株dUTPase结构与酶活性比较[J];病毒学报;2004年02期
3 吴丹,郭瀛军,林懿,孙树汉;猪囊尾蚴抗原DNA疫苗诱导的免疫保护效应[J];第二军医大学学报;2000年06期
4 公茂庆,李连信,赵中平;我国猪带绦虫病和囊虫病的流行现状及危害和防制对策[J];地方病通报;1997年01期
5 唐雨德,周东明;金免疫层析法检测囊虫循环抗原试验研究[J];动物医学进展;2004年05期
6 石团员,田永军,宁长申,张龙现,赖保春,菅复春,邵兆霞,贺桂芬,王进产;猪囊尾蚴抗原成分及其诊断价值分析[J];动物医学进展;2005年07期
7 唐焕文,靳利霞,计明军;蛋白质结构预测的优化模型与方法[J];工程数学学报;2002年02期
8 刘玉冰,戴伟,刘波,尹克霞,徐宏秀,李桂玲,葛凌云;胶体金免疫层析法在脑囊虫病诊断中的应用[J];中国热带医学;2002年02期
9 干小仙;王越;郭建勋;朱建奎;施晓华;;金标渗滤法测定囊虫特异性抗体试剂盒的研制[J];热带医学杂志;2006年01期
10 陈巧林,任宏伟,茹炳根;dUTP焦磷酸酶研究进展[J];生命的化学;2002年04期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 鲁满新;;现代检测技术在食品安全中的应用[J];安徽农业科学;2007年21期
2 孙素玲;;鸡传染性贫血病胶体金快速诊断试纸条的研制——鸡传染性贫血血清抗体的制备、纯化及检测[J];安徽农业科学;2008年12期
3 马寿勇;王联结;;序列上下文氨基酸与其蛋白质二级结构的关系[J];安徽农业科学;2011年30期
4 宇芙蓉;;猪囊尾蚴病免疫学诊断方法的研究进展(综述)[J];安徽卫生职业技术学院学报;2012年03期
5 方强;孙新;;猪囊尾蚴病疫苗研究进展[J];蚌埠医学院学报;2006年02期
6 吴俊英,徐霞,徐振山,郝建华,蒋闺臣;脑囊虫循环抗原和抗体的检测及其临床价值[J];蚌埠医学院学报;1994年03期
7 刘春;王显生;麻浩;;大豆种子贮藏蛋白遗传改良研究进展[J];大豆科学;2008年05期
8 王凤雪,张凡建;几种家畜寄生虫基因工程疫苗研究进展[J];当代畜牧;2004年12期
9 孙树汉,郭瀛军,陈蕊雯,杨桦;核酸疫苗pcDNA3-γcC1诱导囊尾蚴细胞凋亡的作用[J];第二军医大学学报;2000年11期
10 颜宏利,孙树汉,陈蕊雯;利用生物信息学鉴定新发现的膜联蛋白亚家族anx32[J];第二军医大学学报;2002年04期
中国重要会议论文全文数据库 前5条
1 王武军;金颜辉;蔡开珍;;免疫胶体金快速诊断技术在兽医临床诊断中的应用和研究进展[A];福建省科协第五届学术年会卫星会议养猪与畜禽传染防治学术研讨会论文集[C];2005年
2 王武军;金颜辉;蔡开珍;;免疫胶体金快速诊断技术在兽医临床诊断中的应用和研究进展[A];福建省科协第五届学术年会卫星会议养猪与畜禽传染病制治学术研讨会论文集[C];2005年
3 张壮志;张文宝;杨帆;阿布力兹;阿依努尔;吐尔洪·伊米提;石保新;王进成;范元良;;吡喹酮皮肤渗透剂在犬体内的血药浓度测定[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会成立大会暨第一次学术研讨会论文集[C];2008年
4 胡云章;孙茂盛;;生物制品事业面临的机遇与挑战[A];预防医学学科发展蓝皮书·2008卷[C];2008年
5 桑延超;彭志红;李谦;;PSO-GA协同优化算法及其在蛋白质结构预测中的应用[A];2007年中国智能自动化会议论文集[C];2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 孙鹏飞;基于计算智能技术的蛋白质结构预测方法研究[D];哈尔滨工程大学;2010年
2 王雪峰;马传染性贫血病毒弱毒疫苗致弱过程病毒基因的进化研究[D];内蒙古农业大学;2011年
3 郝艳红;猪囊尾蚴发育过程中的超微形态学和膜分子生物学及其药物影响[D];东北农业大学;2000年
4 高学军;猪囊尾蚴的能量代谢变化规律和药物作用机理研究[D];东北农业大学;2002年
5 颜宏利;一个新的膜联蛋白亚家族—AnxB1的鉴定及其抗凝血功能的研究[D];第二军医大学;2002年
6 丁剑冰;新疆细粒棘球蚴95抗原基因疫苗的免疫保护作用及其机制的研究[D];新疆医科大学;2003年
7 贾万忠;带科主要绦虫45W和14ku/18ku基因变异的研究[D];中国农业科学院;2003年
8 余瑛;人酸性成纤维细胞生长因子在大肠杆菌和酵母中的表达、纯化及其特性分析[D];重庆大学;2003年
9 宗瑞谦;猪囊尾蚴cDNA表达文库的构建、筛选及目的基因的克隆和鉴定[D];甘肃农业大学;2003年
10 汪盛;用原子力显微镜(AFM)进行蛋白质晶体生长及成核研究[D];重庆大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 隋晓峰;保加利亚乳杆菌的高密度培养及大豆发酵饮料的研制[D];中国海洋大学;2010年
2 沈麟;分子突变改善扩展青霉脂肪酶的耐热性[D];福建师范大学;2009年
3 于晓丽;蛋白质结构分类研究[D];华北电力大学(北京);2011年
4 王丹;膜蛋白Nramp跨膜区相关肽的结构及功能研究[D];吉林大学;2011年
5 郭晓雯;微小隐孢子虫CP405/CP585双价核酸疫苗的研究[D];吉林大学;2011年
6 牛瑞娟;P450酶系中两类重要蛋白的理论研究[D];吉林大学;2011年
7 王媚娘;抗CDK4人源单链抗体作用机制的研究[D];吉林大学;2011年
8 谢婧;环境扰动诱导蛋白质结构变化的广义二维相关光谱研究[D];武汉理工大学;2011年
9 刘晶;G蛋白偶联受体拮抗剂的QSAR研究[D];大连理工大学;2011年
10 李强;副溶血性弧菌群体感应相关蛋白CqsA的原核表达及结构预测研究[D];暨南大学;2011年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李清;孙振兴;张丽;苏小珊;;Cu~(2+)对栉孔扇贝外套膜组织培养的影响[J];安徽农业科学;2008年23期
2 阎玉河,邵一鸣,潘品良,贾斌,沈荣显;马传染性贫血病毒强、弱毒株dUTPase结构与酶活性比较[J];病毒学报;2004年02期
3 张景山;养殖栉孔扇贝大量死亡的原因和预防对策[J];水产科学;1999年01期
4 张艳;乔军;才学鹏;景志忠;骆学农;王笑笑;;猪带绦虫dUTPase基因真核载体的构建及其在BHK细胞中的表达[J];动物医学进展;2007年06期
5 唐焕文,靳利霞,计明军;蛋白质结构预测的优化模型与方法[J];工程数学学报;2002年02期
6 贺桂珍,李赟,王崇明,黄剑宇,王秀华,宋微波;栉孔扇贝和海湾扇贝病原体感染与疾病发生关系探讨[J];高技术通讯;2003年03期
7 王秀华,贺桂珍,李赟,王崇明,宋微波;栉孔扇贝的急性病毒性坏死症(AVND)病毒多克隆抗体的制备及ELISA分析[J];高技术通讯;2003年09期
8 招丽婵;袁桂萍;程安春;汪铭书;贾仁勇;周登春;陈虹;葛菡;;鸭瘟病毒dUTPase基因的分子特性及转录时相分析[J];高技术通讯;2008年10期
9 刘光远;谢俊仁;田占成;李知新;龚真莉;王路;柴慧萍;才学鹏;;长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库的免疫筛选与初步分析[J];甘肃农业大学学报;2008年01期
10 王宏伟,王安利,王维娜,郭立格;水产动物细胞培养方法及前景[J];河北大学学报(自然科学版);2001年02期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 任伟成;栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒基因组全序列的测定和核酸诊断技术的研究[D];中国海洋大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 张艳;猪带绦虫dUTP焦磷酸酶的体外表达及其组织分布[D];甘肃农业大学;2007年
【二级引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 盖文燕;旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子基因的克隆、表达及抗原性研究[D];中国农业科学院;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 连建安,李淑红,崔黎明;猪囊尾蚴蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳分析[J];白求恩医科大学学报;1990年02期
2 李淑红,崔黎明,长田房子,伊藤洋一;猪囊尾蚴抗原的异质性分析[J];白求恩医科大学学报;1998年06期
3 刘玉冰,徐宏秀,王昌源,尹克霞,李文,杨艳君,葛凌云;金标免疫渗滤法在脑囊虫病诊断中的应用[J];地方病通报;2001年02期
4 郭伟斌,唐焕文,马占新;神经网络预测系统中的输入输出指标研究[J];大连理工大学学报;1999年04期
5 阎玉河,邵一鸣;慢病毒dUTPase结构与功能的研究进展[J];国外医学.病毒学分册;2001年02期
6 鹿振起,于廷阁,于克江,朱文莲,武克勤;定量血片间接血凝试验诊断猪囊虫病的研究[J];黑龙江畜牧兽医;1990年03期
7 郝艳红,李庆章,刘永洁,高学军,高文学,赵冰,孙志学;药物对猪囊尾蚴体外作用的比较研究[J];黑龙江畜牧兽医;2000年02期
8 马云祥,闫旭霞,李文;我国猪带绦虫与囊虫病流行概况及防治对策[J];河南预防医学杂志;1997年03期
9 江学军;唐焕文;;一种前馈神经网络的整体进化方法[J];计算机科学;1999年10期
10 王云诚,唐焕文;单峰函数最优化问题的进化策略[J];计算数学;2000年04期
中国重要会议论文全文数据库 前1条
1 靳利霞;唐焕文;;基于能量极小化的蛋白质结构预测[A];中国运筹学会第六届学术交流会论文集(上卷)[C];2000年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 刘海年,高海兰,张宗森;脂肪中寄生猪囊尾蚴一例[J];青海畜牧兽医杂志;1996年02期
2 何敬军;猪囊尾蚴寄生部位调查[J];中国动物检疫;2002年12期
3 王建设,于明春;浅谈猪囊虫病[J];河北农业科技;1998年01期
4 刘家彦;猪囊尾蚴疫苗免疫的研究[J];畜牧兽医科技信息;1998年08期
5 高学军,李庆章;猪体内囊尾蚴发育过程中能量代谢酶组织化学观察[J];东北农业大学学报;2004年01期
6 邓崇平,李中祥;关于猪囊尾蚴感染调查及防治建议[J];云南农业;1997年07期
7 杨锡林;新发现的抗猪囊尾蚴的异源保护性抗原[J];畜牧兽医科技信息;1996年10期
8 史艳秋,高学军;丙硫咪唑对猪囊尾蚴酶组织化学影响的研究[J];黑龙江八一农垦大学学报;2001年01期
9 杨世明;幼龄猪囊尾蚴轻度感染的检验报道[J];中国动物检疫;2001年06期
10 胡耀辉,韩宇,陈义,阎淑云, 张培因;猪囊尾蚴部分生化指标与物质代谢的关系初探[J];中国兽医杂志;1994年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 国果;李建华;吴建伟;裘学丽;;人体感染猪囊尾蚴报告一例[A];中国动物学会第八次全国寄生虫学学术讨论会论文摘要汇编[C];2001年
2 徐鹏;赵权;杨桂连;门静涛;蔡亚南;姜晶;;仔猪人工感染猪囊尾蚴后血清抗体消长规律的研究[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术研讨会论文摘要集[C];2006年
3 蔡亚南;赵权;杨桂连;徐鹏;门静涛;姜晶;刘春杰;;猪囊尾蚴头节抗原的制备及间接ELISA筛选方法的建立[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术研讨会论文摘要集[C];2006年
4 赵光辉;张改平;宁长申;王选年;张龙现;石团员;宋海涛;鲁琨;;猪囊尾蚴18 kD蛋白基因的克隆、表达及其序列分析[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术研讨会论文摘要集[C];2006年
5 张加力;刘义波;;抗猪囊尾蚴头节单克隆抗体的制备[A];吉林省畜牧兽医学会2007学术年会论文集[C];2007年
6 张媛;赵黎黎;;双抗体夹心ELISA检测猪囊尾蚴头节蛋白含量方法的建立[A];吉林省畜牧兽医学会2007学术年会论文集[C];2007年
7 景志忠;王佩雅;窦永喜;才学鹏;;人-猪囊尾蚴、猪带绦虫动物模型替代性研究进展[A];中国实验动物学会第五届学术年会论文汇编[C];2000年
8 石团员;宁长申;张改平;王选年;张龙现;李青梅;职爱民;菅复春;蔡书军;乔宏兴;;猪囊尾蚴特异性单克隆抗体的制备及其免疫学特性研究[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术研讨会论文摘要集[C];2006年
9 张少华;骆学农;贾万忠;郭爱疆;景志忠;才学鹏;;猪囊尾蚴TS-CC18蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会论文集[C];2009年
10 徐鹏;赵权;杨桂连;门静涛;蔡亚南;姜晶;;仔猪人工感染猪囊尾蚴后外周血中淋巴细胞亚群的动态变化研究[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第九次学术研讨会论文摘要集[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前6条
1 文风;我国攻克世界难题“米猪病”[N];中国食品质量报;2000年
2 ;这里星光灿烂[N];中国医药报;2004年
3 薛志成;猪寄生虫的防治[N];中国畜牧报;2002年
4 汪飞杰;勇于开拓的兽医学专家——才学鹏[N];农民日报;2001年
5 李颖;猪寄生虫的防治[N];河南科技报;2001年
6 夏道伦;猪囊虫的危害性及猪囊虫病的辨认[N];中国畜牧报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前9条
1 高学军;猪囊尾蚴的能量代谢变化规律和药物作用机理研究[D];东北农业大学;2002年
2 刘永杰;猪囊尾蚴的发育生物学药物作用机理[D];东北农业大学;2000年
3 宗瑞谦;猪囊尾蚴cDNA表达文库的构建、筛选及目的基因的克隆和鉴定[D];甘肃农业大学;2003年
4 郝艳红;猪囊尾蚴发育过程中的超微形态学和膜分子生物学及其药物影响[D];东北农业大学;2000年
5 王凯慧;膜联蛋白家族新成员的结构,功能和进化[D];第二军医大学;2005年
6 颜宏利;一个新的膜联蛋白亚家族—AnxB1的鉴定及其抗凝血功能的研究[D];第二军医大学;2002年
7 张毅;膜联蛋白家族新成员的克隆及其结构与功能的研究[D];第二军医大学;2004年
8 袁改玲;猪带绦虫六钩蚴TSOL18重组基因工程疫苗的研制[D];中国农业科学院;2005年
9 范希萍;豆状带绦虫不同发育阶段的结构特征及其致病机理的研究[D];甘肃农业大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 蔡娟;猪囊尾蚴抗原基因GP50的克隆、表达及鉴定[D];安徽医科大学;2004年
2 陈贝妮;猪囊尾蚴不同生长阶段半胱氨酸蛋白酶表达活性研究[D];吉林农业大学;2013年
3 海岗;小鼠抗猪囊尾蚴单链噬菌体抗体库的构建[D];新疆农业大学;2004年
4 李文玲;猪囊尾蚴一种蛋白抗原的分子克隆[D];河北医科大学;2002年
5 赵冰;猪囊尾蚴发育过程中可溶性蛋白的变化及其抗原性的分析[D];东北农业大学;2001年
6 郭爱疆;猪囊尾蚴小热休克蛋白的免疫原性分析[D];新疆农业大学;2004年
7 高文学;猪囊尾蚴的生化代谢规模和药物作用机理[D];东北农业大学;2000年
8 何海艳;猪囊尾蚴cYI基因的原核载体构建及表达[D];河北医科大学;2004年
9 杨洁;猪囊尾蚴特异性抗原基因的cDNA的分子克隆[D];河北医科大学;2003年
10 王秋霞;亚洲型猪囊尾蚴3个低分子量抗原基因的克隆、表达及ELISA检测方法的建立[D];河南农业大学;2009年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026