收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

RNAi介导的抗RSV转基因水稻研究

代玉华  
【摘要】: 水稻条纹叶枯病是热带和亚热带地区最重要的病毒病之一。在我国的粳稻产区一般会造成20~30%的减产。近年来由于气候和耕作的变化以及水稻品种的抗病性较差,我国江苏、山东、河南等地种植的水稻遭受严重的经济损失。水稻条纹叶枯病由水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)引起,RSV是是纤细病毒属(Tenuivirus)的代表种,主要由灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)及其它3种飞虱持久性传播。RSV在电镜下观察呈丝状粒体,以折叠、分枝和超螺旋等形式存在。RSV在寄主植物和介体昆虫体内都能进行复制。RNAi是一种重要基因沉默现象,当表达来源于病毒某一基因或核苷酸序列的转基因植物发生RNA沉默时,能对入侵的同一病毒或同属中相近病毒的RNA进行降解,使入侵的病毒不能在植物中积累,从而赋予转基因植物病毒抗性。本实验室对我国北方34个RSV分离物CP基因进行分析,结果表明CP基因的核苷酸序列一致性在96.8~100%之间,说明我国北方粳稻产区所发生的RSV CP基因非常保守,有利于siRNA的识别。因此,本研究探索利用RNAi原理构建RSV CP基因全长片段或部分片段介导的干涉载体,通过农杆菌介导的方法转化水稻,筛选对水稻条纹病毒产生抗性的转基因水稻后代,利用品种自身的抗性达到主动防治的目的。 本研究首先利用pMCG161载体上的多克隆位点将RSV CP全长或部分片段的正义链、反义链、正反链分别连接到载体上,其中正反链之间由一段载体上的内含子作为间隔,从而形成发夹结构。再根据农杆菌EHA105介导法转化水稻的需要,将初步构建的载体上包含目的基因结构的片段酶切后连接到水稻转化常用载体pCAMBIA1301,最终构建成适合农杆菌介导法转化水稻的载体,构建了含RSV CP全长和部分基因片段的正义链、反义链和正反义干涉载体。此外,通过对pMCG16l空载体和pCAMBIA1301载体的改造,构建了既可用于干涉,又能直接用于农杆菌介导的水稻转化成一种新载体。 利用农杆菌EHA105的介导将构建的干涉载体转入水稻模式品种爱知旭和推广品种皖粳97及秀水11的成熟胚愈伤组织,利用PCR的方法对转化得到的水稻进行目的基因检测,初步鉴定获得以爱知旭为受体的T0代转基因水稻8棵(其中转p1301=CP载体5棵,转p1301=HCP载体3棵),皖粳97为受体的T0代转基因水稻1棵(转p1301=CP载体),秀水11为受体的T0代转基因水稻2棵(转p1301=CP载体)。对转基因水稻再进行GUS、NOS、35S、HPT等几种载体上存在的元件进行检测,初步判断转入水稻的元件基因是否发生丢失。对皖粳97转基因水稻的后代随机抽取样品(T1代20棵、T2代约66棵)进行目的基因检测和元件检测,初步鉴定其中的70棵为阳性转基因水稻后代。为了保证接种压力,首先对实验室饲养的带毒灰飞虱种群进行检测,测得其带毒率为93.40%。利用带毒灰飞虱进行接种实验,每株水稻接种10—12头灰飞虱,接种7天后将灰飞虱转移或杀死,将植株移栽大田或温室。对获得的爱知旭为受体的转基因水稻(T0)及其后代(T1)和皖粳97为受体的转基因水稻(T0)及其后代(T1、T2)进行接种实验,接种后大约55—60天进行抗病性调查。病情调查结果表明,T0代转基因爱知旭水稻有5棵表现高抗,有2棵表现免疫。与非转基因水稻皖粳97相比,转基因皖粳97植株发病延迟,大部分转基因水稻的发病症状明显减轻或者未出现症状。参照抗性评价标准进行抗病性分析,对照皖粳97植株表现高感,T2代皖粳97为受体的转基因水稻中的3个株系表现中感,7个株系表现中抗,5个株系表现高抗(其中3个株系的T1代植株表现免疫)。通过对T0、T1、T2代皖粳97转基因植株的连续抗病性调查,可以看出T1代转基因植株对RSV的抗性可以遗传给T2后代。接种后发病等级为0的转基因水稻植株中病毒CP的含量及其mRNA积累量与非转基因水稻相比明显较低。此外,抽取不同转基因水稻进行外源插入结构的左右边界分析及其旁侧序列测定。转基因秀水11水稻0-1具有不完整的左边界和右边界,通过右边界的序列分析初步推测在0-1中外源片段是多拷贝插入。转基因水稻0-1基因组中既发生了外源载体与水稻基因组的重组,还存在载体之间的重组。通过分析初步确定了外源载体在所扩增到的秀水11基因组序列中的位置,但尚不能定位。同时,分析结果表明转基因皖粳97水稻W1具有完整的右边界利断裂的左边界,其后代W1-18和W1-21具有与其相同的分析结果。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王贵珍,周益军,周雪平;以直接斑点免疫结合测定法检测灰飞虱体内的水稻条纹病毒[J];浙江大学学报(农业与生命科学版);2005年01期
2 乐文静;史文琦;季英华;周益军;;灰飞虱体内Wolbachia的感染与其携带水稻条纹病毒的相关性分析[J];南京农业大学学报;2011年01期
3 程兆榜;邓金花;任春梅;熊如意;周彤;范永坚;周益军;;江苏小麦条纹病毒病的发生及其病原的RT-PCR分析[J];麦类作物学报;2007年06期
4 张国荣;倪文津;;水稻条纹叶枯病发生与防控初探[J];上海农业科技;2007年06期
5 王爽;朱橙;封亚青;张燕;梁国华;杨益众;;不同CO_2浓度条件下灰飞虱体内RSV的定量检测[J];生态学杂志;2010年09期
6 张开玉;熊如意;吴建祥;周雪平;周益军;;水稻条纹病毒编码蛋白在灰飞虱体内的检测及其与CP体外结合研究[J];中国农业科学;2008年12期
7 张开玉;熊如意;周益军;;灰飞虱体内水稻条纹病毒的检测[J];植物保护学报;2008年05期
8 张德胜;乔奇;秦艳红;田雨婷;张振臣;;水稻集中育秧田灰飞虱的空间分布及抽样技术研究[J];河南农业科学;2010年11期
9 熊如意;吴建祥;周益军;周雪平;;水稻条纹病毒NS2基因原核表达产物多克隆抗体制备及受侵染水稻和灰飞虱体内NS2检测[J];植物病理学报;2009年01期
10 刘浩;贺长征;常雪艳;张岩;王晨;;天津地区水稻条纹叶枯病发生规律及防治技术[J];天津农林科技;2009年06期
11 肖冬来;邓慧颖;谢荔岩;吴祖建;谢联辉;;水稻条纹病毒胁迫下灰飞虱基因的差异表达[J];昆虫学报;2010年08期
12 程文金;邓慧颖;谢荔岩;林奇英;吴祖建;谢联辉;;我国水稻条纹病毒致病性的分化与差异分析[J];福建农林大学学报(自然科学版);2009年06期
13 赵敏;张国忠;李荣;吴传伟;马立强;;水稻条纹叶枯病发生及防控技术探讨[J];杭州农业科技;2006年05期
14 周伟民;孙宪雪;;小麦条纹叶枯病的发生及防治[J];农村百事通;2009年04期
15 周伟民;孙宪雪;张秀梅;孙学标;;小麦条纹叶枯病症状特点与防治措施[J];农业科技通讯;2008年05期
16 徐秋芳;乐文静;张金凤;熊如意;周益军;;水稻条纹病毒胁迫对灰飞虱mucin基因表达量的影响[J];植物保护学报;2011年04期
17 孙黛珍;江玲;张迎信;程遐年;王春明;翟虎渠;万建民;;8个水稻品种的条纹叶枯病抗性特征[J];中国水稻科学;2006年02期
18 陈洁;吴丽娟;周彤;魏邦庆;周益军;;江苏省主栽水稻品种对条纹叶枯病与灰飞虱的抗性评价[J];南京农业大学学报;2010年04期
19 孙黛珍;江玲;;水稻抗条纹叶枯病遗传育种研究[J];中国农学通报;2006年12期
20 周彤;吴丽娟;王英;程兆榜;季英华;范永坚;周益军;;灰飞虱从冷冻病叶获得水稻黑条矮缩病毒方法的研究初报[J];中国水稻科学;2010年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 周益军;程兆榜;熊如意;季英华;;水稻条纹病毒与介体灰飞虱互作的相关研究[A];江苏省植物病理学会第十一次会员代表大会暨学术研讨会论文集[C];2008年
2 周益军;程兆榜;熊如意;季英华;;水稻条纹病毒与介体灰飞虱互作的相关研究[A];植物保护科技创新与发展——中国植物保护学会2008年学术年会论文集[C];2008年
3 程兆榜;;水稻条纹病毒流行生态学[A];虫媒病毒病学术研讨会论文汇编[C];2004年
4 程兆榜;刘海建;魏邦庆;周益军;范永坚;谢联辉;;灰飞虱携带和传递水稻条纹病毒规律研究[A];中国植物病理学会2005年学术年会暨植物病理学报创刊50周年纪念会论文集[C];2005年
5 任春梅;程兆榜;季英华;周彤;熊如意;周益军;;灰飞虱携带的RSV主要功能基因遗传多样性[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
6 程兆榜;刘海建;魏邦庆;周益军;范永坚;谢联辉;;灰飞虱携带和传递水稻条纹病毒规律研究[A];中国植物病理学会2005年学术年会暨植物病理学报创刊50周年纪念会论文摘要集[C];2005年
7 张强翔;任应党;林克剑;侯茂林;鲁传涛;;沿黄稻区灰飞虱越冬生物学特性及种群动态研究[A];公共植保与绿色防控[C];2010年
8 刁春友;朱叶芹;张绍明;于淦军;杨荣明;;江苏省水稻条纹叶枯病发生原因分析及防治技术探讨[A];植物保护与粮食安全——第二十届全国植保信息交流暨农药械交流会论文集[C];2004年
9 ;2004年水稻条纹叶枯病防治技术总结[A];虫媒病毒病学术研讨会论文汇编[C];2004年
10 彭高松;王晓鸣;朱振东;段灿星;;不同水稻品种对灰飞虱抗性机理的初步研究[A];公共植保与绿色防控[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 代玉华;RNAi介导的抗RSV转基因水稻研究[D];中国农业科学院;2007年
2 段灿星;水稻抗灰飞虱QTL分析[D];中国农业科学院;2008年
3 温建国;灰飞虱免疫相关基因及微管蛋白基因的克隆和分子鉴定[D];复旦大学;2004年
4 熊如意;水稻条纹病毒基因的原核表达及NS3和NSvc4的功能研究[D];浙江大学;2008年
5 程文金;水稻条纹病毒致病性分化与分子变异[D];福建农林大学;2009年
6 肖冬来;水稻条纹病毒NS2、NS3蛋白与寄主间的互作[D];福建农林大学;2010年
7 吴书俊;水稻抗条纹叶枯病的基因定位及其基因工程育种[D];扬州大学;2006年
8 魏太云;水稻条纹病毒的基因组结构及其分子群体遗传[D];福建农林大学;2003年
9 张珣;六种植物病毒Real Time PCR定量方法的建立及其应用[D];中国农业科学院;2008年
10 黄家权;抗寒基因的克隆及根癌农杆菌介导的ICE1基因转化柑橘的研究[D];华中农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈来;灰飞虱(Laodelphax striatellus)四种组织原代培养及其cDNA RAPD分析[D];福建农林大学;2004年
2 王翠;沿黄稻区水稻条纹病毒分子变异及品种抗性研究[D];中国农业科学院;2009年
3 王贵珍;水稻条纹病毒(RSV)单克隆抗体的制备及检测应用[D];浙江大学;2004年
4 陈苗苗;水稻条纹病毒土传媒介的研究[D];南京农业大学;2011年
5 廖富荣;水稻条纹病毒及其介体灰飞虱的遗传多样性[D];福建农林大学;2004年
6 朱橙;大气二氧化碳浓度升高对灰飞虱获毒、带毒和种群动态的影响研究[D];扬州大学;2009年
7 张开玉;灰飞虱体内水稻条纹病毒的检测及传毒相关蛋白的研究[D];南京农业大学;2008年
8 张德胜;沿黄稻区水稻条纹叶枯病发生规律及防治技术研究[D];河南农业大学;2008年
9 肖冬来;不同传毒能力灰飞虱群体的mRNA差异分析[D];福建农林大学;2006年
10 许存宾;水稻条纹病毒传播介体灰飞虱的种群遗传结构分析及其体内Wolbachia的检测[D];中国农业科学院;2012年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 江苏如东 佘建 马友发;水稻条纹叶枯病防治法[N];福建科技报;2006年
2 吴桥县农业局 赵风娟 铁城镇政府 郝广娣;早防小麦丛矮病[N];河北科技报;2006年
3 于丹;我省粳稻黑条矮缩病进入显症高峰[N];江苏农业科技报;2007年
4 记者 袁春梅 通讯员 马玉萍 魏善涛;秧田灰飞虱大面积爆发[N];连云港日报;2007年
5 于丹;麦收前后用药重治灰飞虱[N];江苏农业科技报;2008年
6 袁春梅 范郁尔;二代灰飞虱卵孵进入高峰期[N];连云港日报;2008年
7 省植保站;灰飞虱虫量高 三大病毒病流行威胁大[N];江苏农业科技报;2011年
8 丁亚鹏;南通地区爆发灰飞虱[N];新华日报;2006年
9 记者  郑在中 通讯员  王炜 张瑞平;防治玉米粗缩病[N];徐州日报;2006年
10 泰州市农业产业发展研究院 李德顺;防治麦田灰飞虱减轻稻田防治压力[N];江苏农业科技报;2007年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978