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《中国农业科学院》 2007年
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黄曲霉毒素B_1高灵敏度检测技术研究

马良  
【摘要】: 黄曲霉毒素B_1(Aflatoxin B_1,AFB_1)危害极大,广泛存在于各种农产品、食品和饲料中,严重威胁人类和动物的生命安全。世界各国设置极其严格的限量标准,造成技术性贸易壁垒,研究建立高灵敏度的AFB_1检测技术,对实施从农田到餐桌的农产品质量控制管理措施,破解技术壁垒,及时发现和剔出受AFB_1污染的产品,防止AFB_1含量超标的产品进入食物链具有重要意义。 本研究根据AFB_1的荧光特性,研究提高AFB_1检测灵敏度的方法:采用激光光源进行激光诱导荧光,建立高灵敏度LIF-HPCE AFB_1检测技术;提出AFB_1配合物的荧光增强效应,研究新型HgCl_2荧光增强剂;建立高灵敏度HPLC柱后HgCl_2衍生AFB_1检测技术;应用HgCl_2的荧光增强效应,建立AFB_1免疫亲和柱净化-荧光快速定量检测技术。主要结论如下: 1.采用375nm小功率(20mW)半导体泵浦固体激光器作为新型的激发光源,与HPCE耦合,搭建了AFB_1高灵敏度检测平台,以MECC分离模式对AFB_1检测,大大提高灵敏度。缓冲溶液:50mmol/L NaDC,6mmol/L Na_28_4O_7,10mmol/LNa_2HPO_4,10%乙腈;λex=375nm,λem=440nm,操作电压15kV,电流104μA,毛细管柱直径75μm,柱长度57 cm,到检测窗口距离50cm。方法精密度RSD<3%,重复性RSD<5%,回收率为84.1%-96.1%,R~2=0.9988。最低检出质量0.17pg,最低定量限0.56pg,绝对检出量的灵敏度提高了3个数量级,显著高于其他方法。 2.通过研究AFB_1与多种金属离子荧光体系荧光值变化情况,确定HgCl_2是一种新型的AFB_1荧光增强剂。室温下Hg(Ⅱ)与AFB_1混匀,反应摩尔比大于1:1时,荧光增强反应体系2min内快速、稳定达到平衡,完成最大增强。比传统的荧光增强剂Br_2水增强程度高2倍以上,大大提高了AFB_1的检测灵敏度;验证了Hg(Ⅱ)离子与AFB_1形成配合物荧光增强效应,发生AFB_1到Hg(Ⅱ)的LMCT跃迁,通过光氧化还原反应,形成稳定的配合产物,使反应物体系中刚性结构加强,共轭体系增加,荧光效率提高,荧光值大大增强。 3.采用HgCl_2对AFT特别是AFB_1、AFG_1、AFM_1进行柱后衍生,建立高灵敏度HPLC柱后HgCl_2衍生检测技术。流动相为甲醇—乙腈—水(22:18:60 v:v:v),荧光检测器检测(λex=365nm,λem=440nm),柱温30℃,流动相流速0.8mL/min;柱后衍生试剂流速0.4mL/min,进样量10μL,可以在13min内同时分离检测五种主要的AFT(B_1,B_2,G_1,G_2和M_1)。AFB_1的最低检出限和最低定量限分别达到了0.05μg/kg和0.17μg/kg,最低检出质量为0.5pg,绝对检出量的灵敏度提高超过了2个数量级。重复性RSD为1.81%,低于5%;精密度RSD为4.28%,在5%以下;回收率为84.67-91.10%,RSD<5%。方法成功分析污染花生,花生酱,花生油,大米,玉米等农产品中的黄曲霉毒素,是检测农产品和食品中黄曲霉毒素可靠有效的方法。 4.将HgCl_2荧光增强效应引入AFB_1免疫亲和快速测定技术中,建立了一套快速、准确、简易的IAC前处理技术,用于农产品及食品中AFB_1,大大提高了速测技术的检测灵敏度,最低定量限0.3μg/kg,同收率>90%,单个样品制备在40min之内,RSD<3%,R~2>0.99,具有操作简单,速度最快,费用最低,准确度高,检测结果直接读数的特点,对环境及检验人员安全性最高,适于现场和口岸检测。
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