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《中国农业科学院》 2006年
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1. 信号分子对水稻细胞过敏反应的诱导作用 2. 甜菜夜蛾生防菌资源的发掘、基因克隆和工程菌的构建

齐放军  
【摘要】: 过敏性死亡反应(简称为过敏反应,HR)是植物抗病反应的特征性反应之一。研究信号分子NO和H_2O_2对水稻HR的诱导作用有助于揭示水稻抗性的产生机制和信号途径。 本研究的主要结论是: 1.成功建立了水稻细胞过敏反应(HR)的定量分析方法,发现溴酚蓝染色法的效果明显优于伊文氏蓝染色法。线形回归分析显示,在0.625~20μg/mL范围内的溴酚蓝最大光吸收值与其浓度间的相关系数为0.9994。溴酚蓝染色法优化的测定条件为:0.03%溴酚蓝染色15min,水洗去除未结合染料,再在50℃下用50%甲醇/1%SDS抽提与死亡细胞结合的染料30min,测定抽提液光吸收值(OD_(595)),以甲醇处理15min的细胞作为全杀死细胞参照。用优化方法测定的水稻细胞死亡率与实际死亡率一致。 2.报道了过氧化氢(H_2O_2)不同添加方法诱导水稻细胞过敏反应(HR)的剂量和时间作用效应。由葡萄糖/葡萄糖氧化酶组成的H_2O_2发生体系能稳定持续产生H_2O_2,有效地诱导HR;然而,直接添加的H_2O_2则被水稻细胞快速降解,不能有效地诱导HR。利用添加过氧化氢酶清除H_2O_2发生体系产生的H_2O_2,控制H_2O_2对水稻细胞作用时间的方法,揭示H_2O_2诱导水稻细胞HR存在时间作用效应。此外,H_2O_2也是水稻与病原细菌不亲和互作中诱导HR的信号组分之一。 3.对信号分子一氧化氮(NO)和过氧化氢(H_2O_2)诱导水稻细胞过敏反应(HR)的协同作用进行了研究。结果表明,这两种信号分子可以独立或协同诱导水稻细胞HR的产生,H_2O_2对NO诱导的水稻细胞HR具有调节作用,但在诱导过程中可能不存在NO与H_2O_2浓度平衡作用机制。 为了从基因组水平上阐明水稻对白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzao,简称Xoo)侵染的感病反应及其机理。用cDNA-AFLP方法对Xoo接种处理不同时间的水稻细胞进行了基因表达图谱的分析。在测定的大约4000个水稻cDNA片段中,363个(9.1%)是差异性表达的,其中295个受Xoo诱导上调表达,68个被抑制下调表达。根据在不同互作时间点的表达特征,它们可分为7种表达类型。对31个差异片段的序列同源性进行分析,发现它们在已公布的水稻全基因组中完全相同的序列,但只有10个基因具有已知或推断的生物学功能,其余21个基因功能未知。用荧光实时定量PCR分析法证实了cDNA-AFLP基因表达结果。对这些差异性表达基因的鉴别,为开展水稻感病性的功能基因组学研究奠定了基础。 为了构建防治农作物危害性害虫甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hüber)的生防工程菌,在分离鉴定甜菜夜蛾致病菌的基础上、对该菌中具有重要生防作用的几丁质酶基因进行克隆,并构建了该基因的高效表达载体,在枯草芽孢杆菌中实现了高效表达。 本研究的主要结论是: 1.从自然罹病死亡的病虫体中分离出甜菜夜蛾致病菌QL-1,对其30项生理特征分析结果表明,QL-1菌株与肠杆菌科(Enterobacteriaceae),沙雷氏菌属(Serratia)中的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的生理特征相符合。进一步用PCR扩增出QL-1的16S rDNA基因片段,测定其序列并进行系统发育分析,结果也表明,该菌株与Serratia marcescens处于同一进化树分支中,相似性达99.2%以上。 2.用设计的特异性引物和PCR技术,成功地从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)QL-1基因组DNA中扩增并克隆几丁质酶A基因(chiA)序列(GenBank登录号:AY433954)。核苷酸序列测定分析结果表明,chiA扩增片段长为1,841bp,含有一个1,692bp的开放阅读框(ORF),编码蛋白ChiA由563个氨基酸组成。氨基酸序列同源性及结构域分析表明,ChiA为糖基水解酶18家族的成员,包括信号肽区(23 AA)、PKD区(73 AA)和催化区(387 AA)三个结构域。 3.将克隆几丁质酶A基因克隆到大肠杆菌和芽孢杆菌的穿梭载体pMA5中,并切除了重组载体中的抗生素标记基因Amp~r,得到重组表达质粒pMA5-chiA-2,转化枯草芽孢杆菌BS168、BCL1050后,实现了几丁质酶的高效表达和分泌。这一安全性生防工程菌的构建为实现病虫害的生物防治建立了良好的基础。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士后
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S511

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【参考文献】
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