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《中国农业科学院》 2008年
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秸秆纤维素高效降解真菌的筛选、鉴定及其纤维素酶基因克隆

刘娣  
【摘要】: 我国每年的作物秸秆产出量约6.5亿吨,折合纤维素含量约2亿多吨,是自然界藴藏最丰富的可再生资源。但是作物秸秆由于组成成分结构的复杂性,不易降解已经成为生产中的障碍,特别在以种植业为主的地区,秸秆在短期内的不易腐解,加上直接还田影响墒情和耕作,导致废弃和焚烧秸秆遍及广大农村,由此引起环境污染和严重的资源浪费,获取高效降秸秆纤维素的微生物菌株及其制剂的应用是解决我国严峻秸秆问题技术的关键。本文进行了秸秆降解微生物的研究,取得了以下主要结果: 利用稀释涂平板法从300个来自吉林,浙江,四川,河北,北京等地的土壤样品中初筛到360株秸秆纤维素降解菌,依据降解菌在平板上降解圈的大小,得到5株降解能力较强的真菌,分别命名为T1,HD5,HD6,HD7和HD24。这5株真菌均能以秸秆纤维素为唯一碳源良好生长。通过形态观察、18S rDNA序列分析和ITS序列分析鉴定这5株菌分别属于肉座菌属的Hypocrea lixii(Trichoderma harzianum)、曲霉属的黄曲霉(Aspergillus flavus)、曲霉属的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、木霉属的Trichoderma koningiopsis和青霉属的草酸青霉(Penicillium oxalicum)。 纤维素降解菌株Hypocrea lixiiT1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7和Penicillium oxalicum HD24在固体平板上和液体培养基中都有很好的降解效果。在固体平板上,秸秆纤维素的添加量为1%时,Hypocrea lixiiT1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7和Penicillium oxalicum HD24 30℃培养7d,固体平板中央出现明显的降解透明圈,为20-25mm不等。在液体培养基中,Hypocrea lixii T1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsis HD7和Penicillium oxalicum HD24在第3d全酶活(FPA)均达到最大,其FPA的最大酶活力分别为25.4U,34.36U,28.85U,31.19U,32.05U,比标准菌株Trichoderma viride(AS3.3711)的酶活力分别高出21.88%,64.87%,38.43%,49.66%,53.79%。它们的最适反应温度均为50℃,但是菌株间产酶的pH值存在差异,菌株T1,HD5,HD6的最适pH值为5,菌株HD7的最适pH值为5.5,而菌株HD24的最适pH值为6。 不同的氮源及其用量影响菌株降解纤维素的FPA活性,确定了菌株最佳的氮源种类及其用量:Hypocrea lixiiT1的最佳氮源为NaNO_3,添加量为1.5%;Aspergillus flavus HD5的最佳氮源为(NH_4)_2SO_4,添加量为2%;Aspergillus fumigatus HD6的最佳氮源为(NH_4)_2SO_4,添加量为0.5%;Trichoderma koningiopsisHD7的最佳氮源为(NH_4)_2SO_4,添加量为1.5%;Penicillium oxalicumHD24的最佳氮源为(NH_2)_2CO添加量为1%。 添加0.1%蔗糖对菌株降解纤维素的FPA活性均呈现抑制作用,而添加0.1%的纤维二糖只对Hypocrea lixiiT1,Aspergillus flavus HD5,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7的FPA活性表现了一定的抑制效应,明显提高Penicillium oxalicumHD24的FPA活性;添加0.1%的Tween 20对Hypocrea lixiiT1, Aspergillus fumigatus HD6和Trichoderma koningiopsisHD7的FPA活性促进作用不明显,但显著提高了Aspergillus flavus HD5和Penicillium oxalicumHD24的FPA活性。 利用SMART cDNA library Construction技术,构建了Hypocrea lixii T1,Aspergillus fumigatus HD6和Trichoderma koningiopsis HD7的cDNA文库:通过抽提总RNA,经反转录合成cDNA第一链,PCR合成第二链,制备了cDNA的全长片段,收集500bp以上的片段,与λTriplE载体重组,其库容量均达到10~9pfu/mL,重组载体经体外包装、转染E. coli LE392,在Amp+的抗性培养基上获得10万多个λ噬菌斑。利用纤维素底物诱导,筛选到了携带纤维素外切酶和内切酶基因的目的克隆子320个,挑选其中45个阳性克隆子,经PCR扩增测序和比对,获得3个新的纤维素酶基因。 采用双向凝胶电泳(2DE)技术,研究了在相同培养条件下Trichoderma viride AS3.3711,Aspergillus fumigatus HD6,Trichoderma koningiopsisHD7和Penicillium oxalicum HD24的蛋白组学,结果表明纤维素酶的活性与其蛋白质的表达密切相关,这些菌株的2DE图谱之间也存在明显的差异,推测这些差异表达的蛋白质点可能与纤维素酶的种类、活性有关。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S141.4

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【引证文献】
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【同被引文献】
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6 白文涛;汉坦病毒受体的筛选及鉴定[D];第四军医大学;2005年
7 李强;白癜风相关黑素细胞膜抗原的分析及鉴定[D];第四军医大学;2005年
8 冯钜涛;蛋白质组学技术筛选肝癌血清标记物[D];复旦大学;2005年
9 陈娟;可卡因安非他明调节转录肽相互作用蛋白的筛选[D];第二军医大学;2005年
10 刘小丽;重型肝炎血清的蛋白质指纹图谱研究[D];浙江大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘娣;秸秆纤维素高效降解真菌的筛选、鉴定及其纤维素酶基因克隆[D];中国农业科学院;2008年
2 夏安;纤维素酶水解动力学及影响因素研究[D];四川大学;2002年
3 贺芸;产耐高温纤维素酶细菌的筛选及酶学性质研究[D];南京理工大学;2004年
4 王在贵;特异腐质霉Humicola insolens(YH-8)纤维素酶的分离纯化及性质研究[D];华中农业大学;2004年
5 王玮;尖孢镰刀菌高产纤维素酶菌株的筛选鉴定及发酵条件优化[D];内蒙古大学;2011年
6 林元山;糖蜜酒精废液诱导康氏木霉产纤维素酶的研究[D];广西大学;2004年
7 舒勤;嗜碱性芽孢杆菌Bacillus sp.AC-2产纤维素酶的研究[D];浙江大学;2004年
8 杨敏;玉米秸秆制取生物乙醇关键技术的研究[D];西北大学;2010年
9 夏友国;产纤维素酶菌株的筛选及不同添加剂在青贮饲料中的应用研究[D];福建农林大学;2010年
10 黄爱玲;玉米秸秆酶水解及发酵乳酸的研究[D];东华大学;2005年
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