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《中国农业科学院》 2008年
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两株猪细小病毒的分子特征及其主要蛋白的原核表达

戚亭  
【摘要】: 猪细小病毒(porcineparvovirus,PPV)能够导致母猪的繁殖障碍,给世界各国养猪业带来了巨大的经济损失。目前,针对PPV主要结构蛋白VP2和非结构蛋白NS1的研究很多,但针对PPV全基因组的研究很少,GenBank中收录的完整的PPV全基因组序列只有两条(GenBankno.U44978和NC_001718),因此,本论文对实验室分离的两株猪细小病L毒X(B-PPV-20-06和LXB-PPV-16-06)进行全基因组序列测定,以分析这两株猪细小病毒基因组的分子特征,G并en结B合ank中收录的我国及国外的猪细小病毒序列,对猪细小病毒的遗传变异做一分析,并对LXB-PPV-20-06株主要的非结构蛋白NS1蛋白和结构蛋白VP2进行原核表达。 通过设计涵盖PPV全基因组的7对引物,分段克隆PPV的基因组片段,将PCR鉴定为阳性的重组质粒送大连宝生物工程公司测序。结果表明LXB-PPV-20-06株和LXB-PPV-16-06株基因组全长分别为5013nt和5031nt,其编码区均不存在碱基的插入与缺失,但在VP1/VP2终止密码子处的非编码区存在不同程度的碱基缺失,分别缺少63nt和45nt,推测可能与毒力变化有关。NS1基因及编码蛋白的多序列比对表明LXB-PPV-20-06株与美国Kresse株和我国的NJ株同源性最高,均为99.4%,PPV-16-06株与我国的SY-99株同源性最高,只有一个氨基酸位点的差异;VP2基因及编码蛋白的多序列比对表明PPV-20-06株与Kresse株同源性最高,其编码氨基酸序列完全一致,LXB-PPV-16-06株与LJL-12株同源性最高。根据VP2蛋白的多序列比对结果以及VP2蛋白215位、378位、383位、436位和565位氨基酸位点的变异情况,发现PPV感染的临床病理型与VP2蛋白这些位点的变异情况密切相关。遗传进化分析表明,我国的猪细小病毒流行株毒在进化树上比较接近。 通过PCR扩增LXB-PPV-20-06株NS1基因和VP2基因全序列,经酶切之后,克隆至pET-32a(+)载体上,经PCR、酶切鉴定,筛选重组表达质粒pET-NS1和pET-VP2,将阳性重组子送公司测序,经序列分析进一步验证重组子构建。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中,经总浓度为1mmol/LIPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析,结果显示PPV-LXB-20-06株NS1基因和VP2基因均获得了良好的表达,用镍柱对融合蛋白进行纯化,融合表达的NS1蛋白的分子量接近97kDa,融合表达的VP2蛋白的分子量接近82kDa。Westernblot检测结果表明表达蛋白具有良好的抗原性,这为NS1蛋白和VP2蛋白在临床诊断中的应用奠定了基础。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S852.65

【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 张振梅;猪细小病毒VP2基因与猪圆环病毒2型ORF2基因真核共表达质粒的构建及免疫原性分析[D];中国农业科学院;2010年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
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9 温武军;鲤抗菌肽基因的克隆及其功能研究[D];山东师范大学;2011年
10 王秀娟;嗜热真菌纤维二糖水解酶(CBHⅠ、CBHⅡ)和内切葡聚糖酶(EGⅠ)的分子改造[D];山东农业大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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2 王树云;斑点叉尾鮰病毒ORF6和ORF10基因的原核表达及其功能的初步研究[D];华中农业大学;2010年
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【同被引文献】
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【二级引证文献】
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【二级参考文献】
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【相似文献】
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