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茶毛虫核型多角体病毒多角体蛋白基因(polh)的表达、抗体制备及检测利用

王礼中  
【摘要】: 杆状病毒是一类基因组为双链环状的DNA病毒,其主要感染节肢动物特别是鳞翅目,双翅目和膜翅目昆虫的一类病毒。杆状病毒科分为核型多角体病毒属(NPV)和颗粒体病毒属(GV)。现已发现的杆状病毒以NPV为主,核型多角体病毒根据病毒粒子中所含核衣壳数量的多少,从形态学上可分为单粒包埋型和多粒包埋型。杆状病毒是调节昆虫种群密度的重要病原因子,它作为一种生物杀虫剂,具有病原特异性较高、安全性好、害虫不易产生抗性,且能在田间长期控制害虫种群等诸多优点而成为生物防治研究中的热点,具有广阔的应用前景。茶毛虫(Euproctis pseudoconspersa Strand)是茶树上的主要害虫之一,茶毛虫核型多角体病毒对茶毛虫具有高的致病性,已在大田中批量用于防治茶毛虫。本文选择茶毛虫核型多角体病毒的多角体蛋白基因(polyhedrin gene)进行表达,利用表达产物制备其抗体,并将抗体应用于定量检测茶毛虫病毒,为茶毛虫核型多角体病毒农药检测提供一种方法,也为其它杆状病毒定量检测探索一条途径。结果研究如下: 1.采用生物测定法测定了茶毛虫病毒对茶毛虫2龄幼虫的毒力,幼虫死亡率(y)对浓度的对数值(x)毒力回归曲线方程为:y=1.3952x-1.7737,相关系数r=0.9975(p<0.01)。 2.以EupsNPV基因组DNA为模板,PCR扩增出全长为741bp的ph基因编码区片段。将Ep-ph编码区插入pET-28-a表达载体中,构建了原核表达载体pET-28-a-Ep-ph,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行了高效的表达。采用传统的割胶方法纯化目的融合蛋白作为抗原,免疫新西兰大白兔,制备了EupsNPV的ph抗体,测得的抗体效价为6.4×10~4。 3.对多克隆抗体的特异性进行Western blotting检测,表明制得的抗体特异性良好。间接ELISA检测茶毛虫病毒样品并绘制了标准曲线,OD_(495)值(y)对病毒浓度的对数值(x)的标准曲线方程为:y=0.4152x-0.8229,相关系数r=0.9897(p<0.01)。最终检测结果显示,测得病毒生物农药制剂样品的值与标准曲线值较符合。


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