鸡贫血病毒VP1、VP2基因在巴斯德毕赤酵母中的表达及产物免疫保护性研究

【摘要】： 本研究根据GenBank已公布的CAV的VP1和VP2基因序列,利用Oligo6.0分子生物学软件分别设计扩增引物,从已构建的载体pBluemCAV重组质粒中分别扩增出VP1及VP2基因,并将扩增出的片段插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,分别构建成重组质粒pPIC9K-VP1和pPIC9K-VP2,将构建好的载体均用SalⅠ线性化后,分别转化给酵母SMD1168细胞,经PCR鉴定、甲醇诱导表达、SDS-PAGE、Dot-Elisa和Western blot试验,结果表明:CAV VP1基因能够分泌表达,在约50KD处出现特异带,经紫外分光光度计测量,重组VP1蛋白在上清中的含量约为15μg/ml;VP2基因经破碎酵母细胞,释放胞内蛋白,在约30KD处出现特异带;经凝胶分析仪分析,紫外分光光度计测量,VP2蛋白占酵母总蛋白的21%。表达蛋白量约为25μg/ml,均属于高效表达。Dot-Elisa结果显示被检重组蛋白CAV VP1及CAV VP2都出现特异性颜色反应;免疫印记试验表明重组蛋白CAV VP1能够与针对CAV VP1的单克隆抗体反应,在50KD处出现特异带,具有良好的反应原性,重组蛋白CAV VP2与针对CAV VP1的单克隆抗体未见反应。分别将重组CAV VP1、CAV VP2蛋白乳化后,免疫6周龄BALB/c鼠,分离血清,Elisa试验结果显示所得血清分别可以与全病毒反应;IFA试验免疫重组蛋白CAV VP1制得的多克隆血清可以和感染CAV的MDCC-MSB1反应,而VP2没有反应。 本研究优化了发酵条件与表达产量的关系,确定重组酵母表达CAV VP1及CAV VP2蛋白的最佳条件为:30℃,pH 6.0,溶氧值40%,空气流量1.25 vvm,当确定甘油耗尽时,通过分批补料的方式进行甲醇补料,诱导表达,最终OD600可达到250或更高,通过比较不同温度下保存重组蛋白的降解率得出表达蛋白保存于-20℃。这一工作为CAV VP1及CAV VP2蛋白的大规模发酵表达和应用打下了良好的基础。 将发酵表达的重组蛋白CAV VP1、CAV VP2经薄层胶扫描、紫外分光光度计定量后,与等体积FREUND’SADJUVANT(SIGMA公司)乳化后,分为对照组、CAV VP1、CAV VP1+CAV VP2三组,分别胸肌注射10日龄CAV阴性SPF雏鸡,免疫前后均采血,分离血清,Elisa试验显示免疫3周CAV VP1+CAV VP2组可检测到抗体,直到4周CAV VP1+CAV VP2组抗体滴度有所升高,5周达到最高滴度,6周后抗体滴度成平稳趋势,CAV VP1组3周可检测到较低抗体,之后抗体水平未见升高,对照组成阴性反应;IFA试验结果表明CAV VP1+CAV VP2组免疫3周后可检测到微弱的中和抗体,4周后可见较强荧光,CAV VP1组和对照组均未见到荧光。同时将乳化后的重组蛋白CAV VP1、CAV VP2分为对照组、CAV VP1、CAV VP1+CAV VP2三组,分别胸肌注射无免种鸡,监测血清及卵黄抗体滴度,Elisa结果显示CAV VP1+CAV VP2组5周血清和卵黄抗体水平同时达到最高,之后波动较小,CAV VP1组及对照组血清和卵黄抗体水平均无明显波动;对免疫后2周孵化雏鸡1日龄攻毒(CAV),对照组攻毒13天增重有明显下降;分别于攻毒后7、14、21天时剖检,进行病理切片检查,免疫CAV VP1试验组和对照组胸腺淋巴细胞坏死、减少,伴有出血、髓质内浆析出;肝细胞空泡变性、小血管淤血;脾脏鞘动脉增生、周围有少量淋巴细胞围绕。免疫CAV VP1+CAV VP2试验组无明显变化。