土壤中粉红粘帚霉67-1荧光定量PCR监测体系的建立及应用

【摘要】： 利用粉红粘帚霉等生防菌制剂防治水稻纹枯病是当前极有潜力的生物防治手段之一。但目前尚缺乏对土壤中外源引入的生防菌进行定位、定量的跟踪分析,及对病原菌与生防菌互作种群动态的研究依据,这很大程度上影响了生物防治的应用。本论文以生防真菌粉红粘帚霉67-1菌株为材料,通过近缘菌株比对,设计出具有种以上特异性探针,建立并优化了实时荧光定量PCR体系,并利用该方法对粉红粘帚霉与水稻纹枯病菌在自然土壤中互作的种群动态进行了初步研究。所得结果如下: 粉红粘帚霉实时荧光定量PCR检测方法的建立与验证:为了建立植病生防真菌粉红粘帚霉67-1菌株的荧光定量PCR检测方法,收集了目标菌株、粘帚霉属其它多个种及近缘木霉属的多个种共20个菌株,并进行了ITS区测序。以200 bp左右差异较大区段设计出探针和引物。其序列如下:前引物:5’-GCGTCATTTCAACCCTCAC-3’;后引物:5’-GAATATCACTACTTCG CAGAGG-3’;LNA探针:5’(FAM)-CGGGTCCGCCACTAGA-(Eclipse)3’。该引物及探针能有效扩增目标菌株,而对其他17株非目标菌株没有扩增。由于两株粉红粘帚霉的ITS区序列高度重复,出现扩增信号,表明所设计的引物和探针具有种以上特异性。以目标菌株的阳性克隆质粒作为标准物质,建立了标准曲线,相关系数为0.9989;扩增效率达95.0%。土壤样品应用实验显示,其直线回归相关系数为0.9989,表明所建立的土壤中粘帚霉67-1菌株荧光定量PCR检测方法合理、有效、快速、实用,符合生态学研究的要求。 土壤中粉红粘帚霉与水稻纹枯病菌互作的种群动态研究:将0.01%、0.1%、0.5% (w/w)的粉红粘帚霉接种体及1%(w/w)玉米砂培养基中培养的水稻纹枯病菌接种体、残体及菌核加入到土壤中,每15 d检测生防菌与病原菌拷贝数变化,共监测6个周期。结果表明,在不同粘帚霉添加量下,粘帚霉与水稻纹枯病菌的DNA含量在前45 d均处于下降趋势,60 d时二者同时出现了上升。75 d时,0.1%及0.5%粘帚霉添加量(w/w)的处理中,纹枯病菌的数量相对于60 d降低30%左右,同时生防菌数量上升。生防菌添加量为0.1% (w/w)时,纹枯病菌数量出现明显回落,因此我们建议粘帚霉作为生防菌的田间施用量为0.1% (w/w)。 为深入了解温度及含水量等环境因子对生防菌及病原菌数量的影响,将0.1%(w/w)粉红粘帚霉接种体及1% (w/w)水稻纹枯病菌接种体添加到土壤中,在不同温度、含水量下培养,对粉红粘帚霉及水稻纹枯病菌拷贝数变化进行监测。其结果表明:在15%含水量,20℃、30℃下,粉红粘帚霉的拷贝数在前10 d急剧下降,在10～50 d中,则持续增长,在50 d时,15%含水量20℃下粘帚霉数量恢复到接种水平的25%;水稻纹枯病菌的拷贝数在前20 d呈持续下降趋势,在30 d时出现短暂的数量回升,在40~50 d时又回落到较低水平(5441.8±3056.4)。结果显示,粉红粘帚霉在15%含水量、20~30℃条件下适宜生长。 本实验成功建立了粉红粘帚霉real-time PCR定量检测体系,为深入研究该菌在土壤中的生态特性和群体动态及其与病原菌互作的种群动态提供了快速、有效的检测方法;为生物防治因子的防效评价方法提供了新依据。