大豆疫霉分子检测及SSR标记的开发

【摘要】： 大豆疫霉引起的大豆疫霉根腐病是大豆上的重要病害,每年在大豆主产国造成严重的经济损失,该菌也是我国重要的进境检疫有害生物之一。因此,研究大豆疫霉的快速、准确鉴定技术以及开发有效的分子标记系统用于种群变异和进化分析等研究具有重要意义。 本研究旨在开发大豆疫霉特异的分子标记,建立用于大豆病株及土壤检测的PCR技术体系,为防止该菌的传播和及时制定病害防治策略奠定基础;通过对大豆疫霉全基因组序列的查询开发有效SSR标记,检测SSR标记用于大豆疫霉遗传多样性分析的有效性和在其他近缘物种的通用性,以期为大豆疫霉的遗传变异、分子作图和系统进化等研究提供一种更加有效的分子标记系统。主要研究结果如下: 1.从大豆疫霉细胞色素氧化酶基因Ⅱ(coxⅡ)序列和两个激发素(elicitin)家族基因EST序列中开发了3对大豆疫霉特异引物: Cox3-F/Cox3-R、PSEL1-F/PSEL1-R和PSEL2-F/PSEL2-R。这3对引物在大豆疫霉中分别扩增出450 bp、289 bp和370 bp的特异性片段,检测大豆疫霉基因组DNA的灵敏度分别为20 pg/μL、2 pg/μL和2 pg/μL。3对引物能够有效检测大豆疫霉侵染的大豆病株,可以用于病害诊断和鉴别。 2.基于保守的EST-SSR标记Psc239,在原引物对的外侧重新设计一对特异引物Psc239EF/ Psc239ER,构建检测大豆疫霉的巢式PCR技术体系。经过对36株P. sojae、25株对照菌和2个大豆品种检测,这两对引物单独扩增及巢式PCR均表现对大豆疫霉的特异性,Psc239EF/ Psc239ER、Psc239和巢式PCR分别只在大豆疫霉扩增出519bp、242bp和242bp的特异片段。单对引物检测基因组DNA的灵敏度均为50 pg/μL,而巢式PCR为50 fg/μL。该巢式PCR方法可以特异地从大豆病株及土壤中检测到大豆疫霉,检测土壤中卵孢子的灵敏度为每1g土壤0.4个卵孢子。对22份随机大豆田土样中进行检测,16份土样为阳性,而使用叶碟诱钓方法只检测出12份阳性土样。 3.通过对大豆疫霉基因组序列查询选出重复次数较多的260个SSRs设计引物,经10个大豆疫霉基因组DNA筛选,设计的260对SSR引物有213对能扩增出SSR特征条带,占引物总数的81.9%。其中多态引物有114对,占53.5%,条带差异多态性引物72对,占33.8%。通用性检测结果显示部分引物在11株其他疫霉菌中表现一定的通用性。基于10个SSR标记的聚类分析表明,这些标记可以将大豆疫霉及其他疫霉区分开。 4.用18对SSR引物分析大豆疫霉菌株的遗传多样性。18对SSR引物在108个大豆疫霉菌株中共扩增出119个等位变异,变异范围为4-9,平均为6.61个,表现出良好的多态性,从而可以用于大豆疫霉遗传多样性的分析。对来自6个不同地区的大豆疫霉的遗传多样性分析表明,中国大豆疫霉存在丰富的遗传多样性;黑龙江、安徽和美国菌株的遗传多样性比较高,这些地方的菌株可能存在广泛的遗传变异;新疆菌株与黑龙江菌株的遗传距离最近,初步认为新疆的大豆疫霉可能来自黑龙江;安徽与黑龙江菌株可能有共同的遗传背景;美国相对较少的供试样品表现出较高的遗传多样性指数,并且从聚类图及遗传距离上可以看出美国和中国的大豆疫霉的遗传背景不一致。