亚洲棉CAP基因的克隆、表达与蛋白鉴定

【摘要】： 本研究以亚洲棉(Gossypium arboreum L.)种质DPL971及其无短绒有纤维突变体(DPL972)为材料。从亚洲棉中分离得到腺苷酸环化酶结合蛋白(CAP)的cDNA表达序列及基因组DNA序列。为深入研究CAP基因对棉纤维发育的作用,对克隆的CAP基因的cDNA序列进行了表达和蛋白表达纯化,还分析了CAP基因在棉纤维早期发育阶段的表达水平及蛋白性质。主要研究结果包括: 1.对253条棉纤维(表皮毛)发育相关基因在DPL971和DPL972基因组中的基因一级结构进行了比较。寻找到了与这对材料表型性状差异紧密相关的目标基因——CAP基因。 2.以DPL971和DPL972为材料,利用RT-PCR技术克隆了亚洲棉的全长CAP基因-GaCAP和GaCAPm。该基因的开放阅读框(ORF)有1416 nt,共编码一个471氨基酸的蛋白质,分子量为50.6kDa。核苷酸序列及氨基酸序列的同源性比较表明:GaCAP及GaCAPm与已经报道的其它物种的CAP基因具有有较高的同源性。 3.对CAP基因在野生型和突变体中的表达谱进行了RT-PCR和Northern杂交分析。结果显示,CAP基因在野生型和突变体材料的棉纤维发育早期阶段(-1～4 DPA)的表达信号稳定。但在突变体材料的4～9 DPA阶段,CAP基因的表达量随着时间的推移呈下降趋势,尤其是在9 DPA时,CAP基因仅有痕量表达。在野生型及突变体材料的叶片、下胚轴和根等组织器官中,均检测到了CAP基因一定丰度的表达信号。上述试验结果显示,CAP基因在棉花各组织器官中均有表达,尤其在棉纤维发育早期阶段的胚珠中表达信号较高;比对CAP基因在野生型及突变体胚珠不同发育阶段的表达信号,推测CAP基因参与了亚洲棉短绒纤维发育的起始过程。 4.按所分离的棉花腺苷酸环化酶结合蛋白cDNA序列设计、合成特异引物,以亚洲棉叶片DNA为模板,通过PCR扩增分离获得棉花GaCAP基因DNA序列。利用DNAStar对该基因的序列进行分析表明:GaCAP基因编码区含有10个外显子和9个内含子,内含子的大小在100～1000 bp范围内不等。CAP蛋白在棉花和拟南芥中的序列长度一致(分别为471和476个氨基酸残基),但其在棉花(序列长度约4kb)和拟南芥(序列长度与2.4kb)基因组中的存在情况不同,说明棉花CAP基因内含子的复杂程度较高。 5.多序列比对结果显示:GaCAP蛋白的C-末端与拟南芥、苜蓿和水稻的相似度达到83%,而N-末端的序列相似性分别为74%、73%和63%。表明GaCAP蛋白的C-末端较N-末端更为保守;CAP蛋白的特征序列:RLE重复基序(RLE repeats)、Actin结合域(actin binding domain)、SH3基序(SH3 motif)和多聚结合域(multimerization domain)均定位在预测的GaCAP蛋白序列之中;GaCAPm编码的蛋白序列的第44位是苏氨酸(极性氨基酸),这与GaCAP编码蛋白序列的同一位置(丙氨酸,非极性氨基酸)不同,而且在不同物种的CAP蛋白中,该位点是极为保守的,因此,这一位点的突变可引起GaCAPm蛋白的结构和功能变化。 6.以GaCAP基因的cDNA序列为探针与基因组DNA酶切片段进行Southern blotting杂交分析,结果显示棉花基因组中仅含有一个CAP基因的拷贝。 7.构建了GaCAP原核表达载体,在E.coli中进行表达,并纯化目的蛋白,进行理化分析。结果显示,GaCAP蛋白的最适反应温度为36℃,并且可以在一个较宽的温度范围(30～60℃)内保持其高结合活性(＞60%);该蛋白的最适pH值在5.0～6.0之间,在pH=4.0的缓冲液中处理30min后,GaCAP的蛋白活性仍然有80%,说明该蛋白有一定程度的耐酸性。

【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：S562