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《中国农业科学院》 2008年
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Delftia tsuruhatensis AD9苯胺降解基因表达调控研究

耿立召  
【摘要】: Delftia tsuruhatensis AD9能以苯胺或邻苯二酚为唯一碳源和氮源进行生长。与目前已报道的其它苯胺降解菌比较,该菌表现出较高的苯胺降解速率和较强的苯胺耐受能力。本研究采用基因敲除、lacZ融合表达、凝胶阻滞实验以及荧光定量PCR等方法,开展了D. tsuruhatensis AD9苯胺降解调控蛋白TadR的功能鉴定和tad基因簇表达调控机制研究。 D. tsuruhatensis AD9苯胺降解基因簇组成结构分析表明,苯胺降解基因分布在三个操纵子。氨基酸序列分析表明,D. tsuruhatensis AD9的TadR属于LysR-type家族的调控蛋白,与苯胺降解菌Pseudomonas putida UCC22的TdnR有97.6%的同源性;OrfS同样属于LysR-type家族调控蛋白,与苯酚降解菌Comamonas testosteroni TA441的AphT氨基酸序列有69%的同源性。苯胺降解基因簇结构基因的表达可能受到这两个LysR-type蛋白的调控。 为了验证苯胺降解基因簇的表达调控,本工作构建了tadR的缺失插入突变株。tadR突变株不能以苯胺为唯一碳源生长,但可以利用邻苯二酚作为唯一碳源进行生长,互补菌株能以苯胺为唯一碳源生长,说明tadR是苯胺降解基因簇中一个重要的基因。凝胶阻滞实验初步证明TadR蛋白在体外能和苯胺降解基因簇的tadQ启动子结合。利用RT-PCR和实时荧光定量PCR对比分析野生型AD9和突变株AD91苯胺降解基因表达情况的差异,结果表明在苯胺存在情况下,tadR基因正调控第一个操纵子的表达,同时也调控orfS基因的表达。 为研究基因的表达情况,构建了tadQ::lacZ和tadD2::lacZ的融合表达载体,并分别导入到野生型AD9和突变株AD91中。β-半乳糖苷酶分析表明,苯胺降解基因组成两个操纵子:tadQTA1A2BRD1C1操纵子编码苯胺双加氧酶和邻苯二酚2,3-双加氧酶,tadD2C2EFGIJKL操纵子编码邻苯二酚间位降解酶系。tadQ启动子的表达在TadR蛋白存在情况下受苯胺诱导。tadD2启动子受到邻苯二酚,粘糠酸和2-羟基苯胺的诱导。诱导谱结果显示,氯代苯胺对该tadQ启动子也有诱导作用,特别是4-氯苯胺的诱导作用比苯胺更为明显。HPLC分析表明,AD9不能降解2-氯苯胺和3-氯苯胺,在生长的后期可以降解微量的4-氯苯胺。邻苯二酚2,3-双加氧酶酶活分析表明,TadC1在苯胺降解基因簇中起主要作用,TadC2对邻苯二酚的降解可能起补偿作用。 PtadQ启动子5’端缺失试验结果表明,1到-148bp的片段是β-半乳糖苷酶表达所必需的,进一步删除导致β-半乳糖苷酶活性的完全丧失,-89到-148bp之间的反向重复序列在启动子转录激活中起重要作用。PtadD2上游反向重复序列IR1对启动子活性表达必不可少。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:X172

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