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β_2受体的表达、纯化及在快速检测中的应用

王迪  
【摘要】: β_2肾上腺素能受体激动剂(β_2激动剂)的非法滥用一直是畜产品安全问题的焦点之一。从盐酸克仑特罗,到莱克多巴胺、齐帕特罗,再到斑布特罗,β_2激动剂类药物不断更新。一种β_2激动剂类药物刚得到控制,又会出现新的药物,畜牧生产中非法使用β_2激动剂的现象屡禁不止,因畜产品中残留而造成消费者中毒事件时有发生。因此,在监控中迫切需要能够建立β_2激动剂类药物多残留的快速筛选检测技术。 β_2激动剂的作用机理是能够被体内的受体蛋白识别,并引发一系列生理反应,因此β_2肾上腺素能受体(β_2AR)是一种可以识别各种β_2激动剂的蛋白,其与β_2激动剂的结合具有特异性和高亲和性。本研究利用本实验室克隆的大仓鼠肺细胞β_2AR基因分别在原核及哺乳动物细胞中进行外源表达并纯化,将受体作为识别所有β_2激动剂的元件代替抗体,组成受体-β_2激动剂-酶反应系统,为β_2激动剂的多残留检测提供研究基础。 通过大肠杆菌原核细胞表达N端融合麦芽糖结合蛋白(MBP),C端融合组氨酸标签(6his)的β_2AR重组蛋白。构建三个原核表达载体,pMAL-p2x-β_2AR(SX),pMAL-p2x-β_2AR(EX),pMAL-p2x -β_2AR(EX-62),SX为蛋白酶稳定型载体,EX为表达全长蛋白,EX-62为截去N端62个氨基酸的截短蛋白。经SDS-PAGE,Western blotting检测融合蛋白得到表达,将表达全细胞经放射性配基(125I标记的β拮抗剂-氰心得静,ICYP)检测显示蛋白具有与ICYP结合的活性,并且这种结合活性被β_2激动剂特异性抑制。用检测克仑特罗的ELISA试剂盒测定三种表达菌液的中带有的活性蛋白浓度分别为:1.29 pmol/L,2.06 pmol/L,0.99 pmol/L。 为了提高蛋白活性及表达量,在哺乳动物细胞中表达融合绿色荧光蛋白(GFP)的重组蛋白。表达细胞选择人胚胎肾细胞HEK293,分别建立自表达及诱导表达系统。构建自表达载体pCDNA3.1+-β_2AR-GFP,N端融合6His标签,C端融合GFP蛋白,瞬时转染HEK293细胞,可以检测到蛋白表达,融合蛋白具有绿色荧光性,并经SDS-PAGE,Western blotting检测有特异性蛋白表达。但是无法筛选稳定转染细胞。为了获得稳定表达β_2AR的稳定细胞株,建立四环素诱导的表达系统。筛选稳定转染单克隆细胞,扩大培养后,加入四环素1μg/mL诱导蛋白表达。经放射性配基ICYP检测显示其具有与ICYP结合的活性,并且这种活性被β_2激动剂特异性抑制。 为了进一步提高蛋白的表达量,经过受体蛋白疏水性分析,根据蛋白的立体结构,在不影响β_2激动剂结合的位点,将疏水氨基酸突变为亲水氨基酸。用套叠PCR法进行基因突变,构建两个突变体:突变体一分别对七个跨膜域氨基酸进行突变,突变体二将二,四,六位氨基酸进行突变。构建突变原核表达载体pMAL-p2x-β_2AR1,pMAL-p2x-β_2AR2,并对蛋白的原核表达进行初步研究。 蛋白纯化方面,细胞经多次超速离心后,使用非离子去垢剂将受体蛋白从细胞膜上解离,原核细胞表达蛋白经Amalso亲和柱纯化,哺乳动物细胞表达蛋白经镍柱纯化,获得纯化的β_2AR蛋白。原核表达蛋白1L培养基中纯化受体量为0.198 mg,约占粗膜蛋白的1.67%;哺乳动物细胞从四板细胞培养瓶(15cm)中纯化受体量为0.135 mg,约占膜蛋白的3.8%,结果显示哺乳动物表达的受体蛋白比例高于大肠杆菌表达。经SDS-PAGE和Western blotting检测,纯化后的融合蛋白具有特异结合抗体的能力。使用斑点-ELISA及斑点-酶联配基法,对纯化后β_2AR蛋白的配基结合活性进行检测,表明粗膜蛋白及纯化蛋白保持与克仑特罗特异性结合的活性。 分别将表达细胞的粗膜蛋白和纯化β_2AR受体包被于96孔聚苯乙烯板,以辣根过氧化物酶(HRP)偶联的克仑特罗和游离的克仑特罗,莱克多巴胺及沙丁胺醇构成竞争型检测试剂盒,进行β_2激动剂的多残留检测。随着游离克仑特罗等β_2激动剂浓度的增加,HRP的酶促显色反应明显得到抑制,而对照组蛋白则无此反应。测定克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇对粗膜蛋白及纯化蛋白的IC_(50)值,说明β_2AR受体对不同β_2激动剂都有亲和性,但是对克仑特罗的亲和力最强。尿样添加回收实验中,空白尿样添加浓度分别为1 ng/mL,10 ng/mL,100 ng/mL,同时用受体包被酶标板及ELISA试剂盒检测,在受体包被板中添加浓度为1 ng/mL时平均回收率仅达到40%,添加浓度为高浓度时(10 ng/mL,100 ng/mL)回收率达到70%左右,ELISA试剂盒的回收率均达到85%。但是受体检测法用一种试剂盒,一种酶标竞争物,可是检测多种β_2激动剂,而ELISA试剂盒则需要多个试剂盒检测多种β_2激动剂。影响受体检测结果的因素有很多,包括体外表达蛋白的活性,蛋白的纯化过程中活性的保持以及受体检测方法的摸索,随着研究的深入,受体检测法的优势将远大于免疫分析法。


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