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《中国农业科学院》 2008年
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六种植物病毒Real Time PCR定量方法的建立及其应用

张珣  
【摘要】: 植物病毒的检测是植物病毒病监测防控中最为重要的环节之一。以往常规的血清学检测,核酸杂交检测和传统PCR技术在植物病毒检测应用方面都或多或少存在着不完善的地方。因此,本研究以荧光定量PCR技术为基础,锚定水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)、三种大麦黄矮病毒(Barely yellow dwarf viruses,BYDVs)、小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus,WDV)和黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的CP序列基因保守区域,分别建立了各自的用于定量检测的Real Time PCR方法。同时,应用这些方法对这几种病毒进行了初步的定量检测研究。主要内容如下: 1.建立了一套用于定量检测RSV的One Step Real Time RT-PCR方法。通过序列比对,在RSV CP序列保守区域内设计特异性的引物和探针;通过在GenBank中用BLAST进行比对,证实引物探针特异性很高。对RSV One Step Real Time RT-PCR反应体系进行优化,最佳的引物和探针终浓度均为0.2μmol/L。建立标准曲线,检测灵敏度可达到20拷贝/20μl体系,曲线斜率和扩增效率均符合定量要求。通过与ELISA检测技术的灵敏度对比,该实时荧光定量PCR方法展现出极高的灵敏性。对感RSV水稻不同组织内和单头带毒灰飞虱体内RSV CP RNA进行绝对定量检测。结果显示,水稻叶片中病毒RNA含量高于茎组织;雌虫灰飞虱体内较雄虫携带有更多的病毒RNA,并且虫体的胸腹部是病毒RNA最主要的聚集区,而虫体头部病毒RNA含量极低。 2.针对BYDV GPV、GAV和PAV的定量检测,分别建立了One Step Real Time RT-PCR方法。三套独立的检测体系检测靶基因序列均位于BYDV CP保守序列上。GPV检测探针标记FAM荧光基团,GAV检测探针标记CY5荧光基团,PAV检测探针标记HEX荧光基团。建立标准曲线,三套定量检测体系的检测灵敏度均可以达到50拷贝/20μl体系,曲线斜率和扩增效率均符合定量要求。通过对感病小麦的检测证明所建立的Real Time PCR体系是成功的。 3.建立了一套用于定量检测WDV小麦株系的Real Time PCR方法。通过序列比对,分别在WDV小麦株系CP基因和长非编码区设计了两组引物探针。其中锚定长非编码区的引物和探针组合可以很好的区分WDV小麦株系和大麦株系。使用锚定CP基因的引物探针组合建立Real Time PCR定量检测方法。通过对反应体系进行优化,最佳的引物和探针终浓度均为0.2μmol/L。建立标准曲线,检测灵敏度可达到30拷贝/20μl体系,曲线斜率和扩增效率均符合定量要求。通过与ELISA检测技术的灵敏度对比,该实时荧光定量PCR方法展现出比ELISA检测要高的多的灵敏性。通过对田间采集的26组疑似WDV侵染小麦样品进行定量检测,其中24组样品检测为阳性,病毒检出率为92.3%。而同时采用传统普通PCR进行检测,仅有12组样品检测为阳性,病毒检出率不到50%。由此可见,本研究中所建立的荧光定量检测方法相对于传统PCR检测具有更高的灵敏度。对采集自病区的单头条沙叶蝉体内WDV进行绝对定量,结果显示该定量方法适合于单头介体昆虫带毒量的检测;进而为小麦产区WDV介体昆虫带毒率分析提供了一种新颖的,灵敏的,准确的手段。使用第二组引物探针,针对本实验室采集的大麦样品进行WDV小麦株系的检测。结果显示,样品YNKM-29,YNKM-38,YNKM-39和YNKM-43可以检测到WDV小麦株系DNA。 4.建立了一套用于定量检测CGMMV的One Step Real Time RT-PCR方法,并首次将检测靶基因锚定于病毒CP基因上。通过摸索改进,建立了一套比较适合提取富含多糖多酚植物样品总RNA的方法。对反应体系进行优化,最佳的引物和探针终浓度均为0.2μmol/L。建立标准曲线,检测灵敏度可达到50拷贝/20μl体系,曲线斜率和扩增效率均符合定量要求。利用建立的定量方法对西瓜种子不同部位组织带毒量进行了检测。结果显示,子叶组织中病毒RNA含量极高,外种皮次之,内种皮最低。由此可见,子叶是西瓜种子内病毒RNA聚集最为主要的部位。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S432.41

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