植物青枯菌群体猝灭基因的功能研究及利用

【摘要】： 植物细菌性青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种世界性重大病害。青枯菌的寄主范围非常广泛,涉及50多个科的200种植物,其中包括马铃薯、番茄、茄子、辣椒、甘薯、花生、烟草、香蕉、桑树、桉树、油橄榄等许多重要的粮食、蔬菜及经济作物。 植物病原细菌毒性基因的表达受群体感应(quorum-sensing)信号分子-AHL(酰基高丝氨酸内酯,N-acyl homoserine lactone)的调控,降解细菌产生的AHL信号分子,猝灭其群体感应,能够降低细菌的致病力。 1.青枯菌aac基因的克隆及原核表达产物的功能分析 克隆了青枯菌的aac(aculeacin A acylase)基因,构建了aac基因的原核表达载体,获得了AAC融合蛋白,证实了AAC蛋白能够降解细菌的AHL信号分子,猝灭细菌的群体感应,明显减弱病菌的致病力。 2.青枯菌aac基因突变株的构建及其致病性分析 为明确aac基因在青枯菌致病过程中的作用,构建了aac基因重组自杀质粒,并将其电转化至青枯菌野生型菌株中,经过体内同源重组,获得了aac基因插入突变株。接种番茄的结果显示,aac突变株的致病性较野生型明显下降,证明了aac基因在青枯菌致病过程中起重要作用。 3.抗青枯病转aac基因烟草和番茄的培育 为进一步研究aac基因的功能,构建了aac基因高效植物表达载体pBI121-Ω4A-aac,转化至农杆菌,应用叶盘法分别转化至烟草和番茄。经过愈伤诱导及卡那霉素(Kan)筛选,分别获得了35株转基因烟草和15株转基因番茄。经过PCR、RT-PCR、Southern、ELISA检测,表明aac基因已经成功整合到转基因植株的基因组中,并得到正确的表达。接种青枯菌结果显示,转aac基因烟草和番茄的抗病性明显的增强,提高2-2.9个抗性级别,评价为中等抗病水平,表现为发病时间延迟,病情指数的降低。证明将青枯菌群体猝灭基因导入植物,是提高植物对青枯病抗性的有效策略。 4.青枯菌毒性蛋白分泌系统Gsp蛋白互作分析 为验证群体感应调控下与青枯菌毒性蛋白分泌相关的II型分泌系统Gsp蛋白间的互作,将青枯菌gspC、E、M、L基因克隆至不同的原核表达载体中,表达成Gsp C、E、M、L融合蛋白。通过包涵体蛋白变复性研究,获得了具有活性的复性后蛋白质。蛋白质体外结合试验(Pull-down)结果显示,GspE和GspL,GspL和GspM蛋白之间可发生相互作用。利用体外蛋白结合技术进一步验证了Gsp蛋白互作的真实性。