水稻白叶枯病菌转录调控因子Clpxoo的分子鉴定及功能分析

【摘要】： 水稻黄单胞水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)引起的水稻白叶枯病是世界水稻生产上重要的细菌性病害之一。Xoo与水稻相互作用过程中可能存在信号调控网络及其机制,通过信号感应、接受和传递,严格控制致病性/毒性相关基因的表达,实现对寄主植物的成功侵染。然而,至今尚不清楚Xoo毒性及其基因表达的信号调控机制。据报导,环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)是近年来新发现的、广泛存在于细菌中的第二信使,调控了细菌的生物学功能。近年来,为了阐明Xoo核苷酸信号途径及其作用机理,本实验室开始对c-di-GMP信号途径及其功能进行了研究。本研究重点对推导的c-di-GMP信号受体蛋白Clpxoo进行了分子鉴定和功能分析。 研究内容有:(1)对Clpxoo进行了基因克隆、序列分析、缺失突变和互补及其相关表型的鉴定。(2)利用RT-Q-PCR方法,定量测定了△clpxoo中鞭毛基因簇基因和编码过氧化氢酶基因的转录本;利用生物信息学方法,确定启动子区域含有Clpxoo结合保守序列的基因。(3)表达和纯化了Clpxoo蛋白。 clpxoo基因序列与大肠杆菌crp和铜绿假单胞菌vfr的同源性较高,与其它几种病原黄单胞菌clp基因高度保守。Clpxoo是推测的c-di-GMP受体分子,N端具有环化核苷酸cNMP结合结构域(CAP_ED),C端具有保守的DNA结合结构域(HTH_CRP)。HTH结构域是转录调控因子的典型特征,一般通过结合靶基因启动子区域、激活或抑制基因转录。 与野生型菌株PXO99A相比,△clpxoo的致病力、运动性、胞外多糖产生能力和对H2O2的抗性均显著降低,基因互补可使之部分恢复,证实Clpxoo具有转录调控功能。但是△clpxoo胞外酶产生和对烟草致敏性无显著变化。 对基因转录本分析表明,Clpxoo正调控鞭毛合成主控因子fleQxoo表达。同时,鞭毛素蛋白基因fliCxoo、σ28因子编码基因fliAxoo、鞭毛冠蛋白基因fliDxoo、基体蛋白基因fliLxoo也受到Clpxoo正调控。fleQxoo启动子序列分析发现,在距翻译起始密码子上游382bp和133bp两处具有Clpxoo结合保守序列,表明Clpxoo可能通过直接控制fleQxoo、调控鞭毛基因簇基因的表达。此外,Clpxoo正调控烷基过氧化氢还原酶基因ahpCxoo,负调控单功能过氧化氢酶基因katExoo,表明在Xoo中存在Clpxoo对H2O2解毒的调控机制,其具体调控过程还有待深入研究。 本研究还构建了带有His-Tag的Clpxoo表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导条件下表达目的蛋白,并通过Ni2+离子交换树脂进行蛋白纯化。Clpxoo蛋白的成功表达和纯化,为进一步证实Clpxoo上游接受来自c-di-GMP信号,下游直接调控fleQxoo等基因表达奠定了基础。 总之,本研究阐明了转录调控因子Clpxoo对细菌毒性、运动性、胞外多糖产生和H2O2解毒具有重要的调控作用。揭示了围绕Clpxoo可能存在的信号传导途径。