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《中国农业科学院》 2009年
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表达O型口蹄疫病毒VP1基因的重组牛疱疹病毒1型的构建及其在兔体内的免疫原性研究

任宪刚  
【摘要】: 牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是由牛疱疹病毒1型(Bovine hepervirus-1,BHV-1)引起的以牛呼吸道病为主要临床症状的疾病,是造成养牛业损失的一种重要传染病。BHV-1为α疱疹病毒,基因组为135kb左右的双链DNA,像其他疱疹病毒一样,BHV-1基因组中有许多病毒复制非必需基因,可允许插入外源DNA,且BHV-1具有感染宿主范围小,弱毒株致弱背景明确的优点,是最有望成为构建多价牛传染病疫苗的理想载体,现已有很多外源病毒DNA成功地插入到了BHV-1基因组中。 口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)引起偶蹄动物的一种高度接触性、传染性疾病,FMD能够形成全球大规模流行,造成巨大经济损失。FMDV属于小RNA病毒科,基因组为单股正链RNA。研究证实结构蛋白VP1具有与细胞受体结合的主要功能,是病毒感染细胞的关键,且VP1蛋白可在体外实验及自然宿主中诱导产生中和抗体,是研究各种FMD基因工程疫苗的首要候选蛋白。 本研究旨在构建表达FMDV(O/China/99)VP1基因的重组BHV-1,并对其部分生物学特性以及在动物体内的免疫原性进行研究,为研制口蹄疫及其他重要牛传染病的BHV-1病毒载体疫苗奠定基础。 为了构建表达O型FMDV(O/China /99)VP1基因的重组BHV-1,利用人工合成的基因质粒与构建BHV-1 gE基因缺失转移载体时所用的质粒,构建了含VP1表达盒的gE基因缺失转移载体,该载体含有巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)早期启动子控制下的VP1基因、以及用于同源重组的BHV-1gE基因上游与下游同源重组序列。采用磷酸钙介导转染法将该转移载体与自行构建的呈gE基因缺失、并引入大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(β-Galactosidase gene,LacZ)的重组病毒BHV-1/gE-/LacZ+基因组DNA共转染牛鼻甲细胞,采用反向病毒蚀斑筛选法,获得了表达VP1基因的重组病毒BHV-1/gE-/VP1,PCR检测结果表明VP1基因已经插入到了重组病毒BHV-1/gE-的基因组中,间接免疫荧光试验和Western blot证实了BHV-1/gE-/VP1中的VP1基因在感染的细胞中获得了表达。 为了鉴定FMDV(O/China/99)VP1基因在BHV-1/gE-/VP1感染细胞中的表达,以原核表达系统表达了FMDV(O/China/99)VP1基因并制备了其多克隆抗体作为基础材料。首先采用PCR方法从质粒pUC57-VP1中扩增FMDV VP1基因,并将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pET30a-VP1。重组质粒鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE结果显示重组蛋白的分子量约为38ku,以包涵体的形式存在。Western blot与间接ELISA结果显示重组蛋白能够与FMD阳性血清反应。将初步纯化的重组蛋白免疫BALB/c鼠制备多克隆抗体,作为鉴定VP1基因在重组病毒感染的细胞中获得表达的基础材料。 为了比较BHV-1/gE-/VP1与亲本病毒(BHV-1/gE-/LacZ+)之间的增殖能力、BHV-1/gE-/VP1的遗传稳定性以及在动物体内的免疫原性,测定了BHV-1/gE-/VP1和BHV-1/gE-/LacZ+在MDBK细胞上的半数组织培养感染量(50% tissue culture infective dose,TCID50);并将BHV-1/gE-/VP1连续在MDBK细胞上传15代,取5、10、15代病毒,提取病毒基因组DNA后扩增VP1基因;以及将1ml 1×107.0 TCID50的BHV-1/gE-/VP1和1ml 1×107.0 TCID50的BHV-1/gE-/LacZ+分别皮下免疫4只新西兰白兔后,每周采血,首免两周以同样剂量加强免疫,分别采用病毒中和试验和间接ELISA法检测免疫动物血清中的IBRV和FMDV VP1的抗体。结果表明BHV-1/gE-/VP1和BHV-1/gE-/LacZ+的TCID50分别为107.9/ml和107.3/ml;以5、10、15代病毒基因组DNA为模板均能扩增出VP1基因;中和试验和ELISA能够分别检测到BHV-1/gE-/VP1免疫动物血清中的IBRV和FMDV VP1的抗体。 本研究构建了表达FMDV VP1基因的重组病毒BHV-1/gE-/VP1,且VP1基因能够在感染BHV-1/gE-/VP1的细胞中获得表达;与BHV-1/gE-/LacZ+相比,BHV-1/gE-/VP1的增殖能力无差异,VP1基因也能在BHV-1/gE-/VP1的传代过程中稳定存在;动物试验表明BHV-1/gE-/VP1能够诱导兔体产生抗IBRV和FMDV VP1蛋白的抗体。该研究为研制口蹄疫及其他重要牛传染病的BHV-1病毒载体疫苗奠定了基础。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S852.65

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