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水稻白叶枯病菌群体感应信号DSF和c-di-GMP系统中重要基因的鉴定和功能分析

孙蕾  
【摘要】: 水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo)引起的白叶枯病是世界水稻生产上最严重的细菌病害之一。水稻—白叶枯病菌互作己成为植物—病原物互作机理研究的重要模式系统之一。长期以来,通过对Xoo致病功能基因的鉴定和分析,大大增加对其致病机理以及与水稻互作分子基础的认识。尤其是3个Xoo菌株全基因组测序的完成以及功能基因组学方法的应用,为开展Xoo致病功能基因的研究提供了坚实的基础。然而,由于病菌致病性/毒性并不只是由少数几个基因控制的,而是由复杂的细胞信号通讯(cell-cell communication)或群体感应(quorumsensing,简称QS)机制所调控的。对Xoo群体感应、信号系统以及关键基因的结构与功能、表达与调控的认识至今仍很有限。对Xoo群体感应信号系统调控网络的研究,有利于解析其致病性/毒性机理,为发展新型、有效和可持续的病害控制策略和方法提供科学依据。 为了阐明Xoo在水稻侵染植株中是否存在群体感应现象,本研究利用以lipA和purH为靶基因序列的实时定量PCR(real-time PCR)方法,分析了Xoo在接种水稻植株内的种群量变化动态,建立了水稻白叶枯病分子定量“病菌靶基因拷贝数—DNA总量—种群量—植物病症”的研究模型,并在水稻细菌性条斑病中得到验证。Xoo接种3d后,水稻植株内己有菌量积累,但不显症;接种5d后,菌量显著增加,植株显症并逐渐加重;接种9-14d菌量增至峰值,并进入稳定平台期,植株显症严重。Xoo菌量至少要达到10~8-10~9CFU/克叶片组织才能成功引起寄主发病。推测Xoo可能利用细菌中普遍存在的群体感应机制调节对寄主水稻的侵染。 为了鉴别Xoo群体感应信号途径,本研究首先使用信号报告菌株检测到Xoo存在与Xcc相同的群体感应可扩散信号因子(DSF)、而非高丝氨酸内酯类(AHL)信号。生物信息学分析表明,在Xoo基因组中存在与Xcc在结构上高度同源和保守的rpf基因簇,该基因簇与DSF信号生物合成和传导有关。用标记置换法,构建了与DSF信号系统有关的ΔrpfFxoo、ΔrpfCxoo和ΔrpfGxoo单基因缺失突变体以及ΔrpfFCxoo、ΔrpfFGxoo双基因缺失突变体。与野生型菌株PXO99~A相比,ΔrpfFxoo、ΔrpfFCxoo和ΔrpfFGxoo均不产生DSF,而ΔrpfCxoo过量产生,ΔrpfGxoo产量减少。将rpfFxoo、rpfCxoo和rpfGxoo分别互补到甘蓝黑腐病菌XC1菌株的对应基因突变体中,可以恢复与野生型XC1相同的DSF产生表型。此外,尽管ΔrpfFxoo胞外多糖(EPS)产生无明显变化,而其它突变体EPS产生均显著减少;所有突变体胞外酶产生、HR和运动性均无明显改变;所有突变体对水稻的致病性均显著降低,在水稻叶片中的扩展长度和菌量显著下降,其中ΔrpfFCxoo和ΔrpfFGxoo致病性变弱更为明显。因此,rpfxoo基因在功能上起着与rpfxcc相似的作用,推测RpfFxoo与合成DSF信号有关,RpfCxoo和RpfGxoo组成双组分系统(TCS),RpfCxoo感应环境中的DSF信号,RpfGxoo通过降解细胞环鸟苷二磷酸(c-di-GMP)信号分子,从而调控下游基因的表达及其表型。 c-di-GMP是一种由2个GTP组成的、新的细菌第二信使,可以调节运动性、生物膜形成和毒性因子合成等多种生物学表型。生物信息学分析表明,在Xoo基因组中大约有25个基因可能具有参与c-di-GMP代谢的功能。用标记置换法,分别构建推测具有c-di-GMP降解活性的磷酸二酯酶基因rsvRxoo(XOO2563)及其REC、GGDEF和EAL结构域缺失突变体。rsvRxoo缺失突变导致了EPS产生显著减少,对水稻的致病性下降,但是DSF信号产生、胞外降解酶和运动性无明显变化;3个结构域均与EPS产生有关,缺失其中任何一个结构域的突变体都不能正常产生EPS。表达rsvRxoo的E.coli菌株可以产生大量的DSF信号分子,这一过程需要GGDEF和EAL结构域的同时存在、而不需要REC结构域的存在。rsvRxoo基因可以互补ΔrpfCxoo和ΔrpfGxoo的EPS产生表型,但是rpfCxoo和rpfGxoo却不能互补ΔrsvRxoo的EPS产生表型。推测rsvRxoo可能与rpfC/rpfGxoo双组分系统属于两条途径来调控细菌EPS产生。此外,用标记置换法构建具有c-di-GMP合成活性的环化酶基因rsmRxoo缺失突变体。该基因突变可以引起细菌运动性下降,但是不影响鞭毛产生和对水稻的致病性,表达rsmRxoo的E.coli菌株同样产生大量的DSF信号物质。 总之,本研究通过对Xoo在水稻侵染中的群体感应的鉴别,DSF信号分子检测,DSF和c-di-GMP信号途径中重要功能基因的分子克隆、缺失突变、互补以及生物学性状的测定,初步阐述和勾画了在Xoo群体感应系统中DSF—c-di-GMP—致病性/毒性表达的信号调控网络。一方面可以通过RpfC、RsvS等感应激酶接受胞外环境中或者来自于寄主的特异性刺激信号,另一方面又通过RpfG、RsvR和RsmR等反应调节子将刺激转化为胞内特殊信号如DSF和c-di-GMP,进而调控Xoo的毒性、EPS产生、运动性、胞外酶活性、生物膜形成等多种生物学表型的变化。


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