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紫茎泽兰分子研究平台的建立及化感相关基因EaCHS1的克隆

郭惠明  
【摘要】: 紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum. Sprengel)是一种入侵性很强的恶性杂草,起源于墨西哥和哥斯达黎加一带,它具有生命力强、传播速度快,植株本身毒性大,对土壤养分的吸收性强,分泌化感物质等特点,目前已经广泛分布于世界热带、亚热带30多个国家和地区,对森林、农田等生态系统造成的严重威胁,对入侵地区的经济、生态和社会造成了重大损失。该恶性杂草于20世纪40年代由中缅边境传入我国,在国家环保局首批定为最重要的16种外来入侵物种中,紫茎泽兰名列首位。目前国内外对于紫茎泽兰的研究主要集中在其入侵模式、生态学特性、防除方法和利用等方面。紫茎泽兰化感物质在生物入侵过程中发挥了重要的作用,其作用机制可能是通过影响植物光合作用、各种代谢以及根系生长和对矿质元素吸收等许多方面来实现入侵。然而目前,对于与次生代谢相关的化感物质的代谢调控机理方面的研究还很少,本文就是围绕这一点开展研究工作。针对紫茎泽兰基因的克隆和功能分析建立了研究平台,通过开展紫茎泽兰的化感相关的代谢途径的研究,为这种恶性杂草的综合治理提供理论依据,以期能够找到调控化感物质代谢的关键酶的编码基因,发掘一些能够为农业生产所利用的新基因。本论文的研究结果如下: 1.构建了紫茎泽兰叶片cDNA文库。通过SMART的方法合作构建了高质量的紫茎泽兰cDNA文库。原始文库的滴度为1.23×107 cfu/mL,重组率达98 %,插入片段平均大小在900 bp左右,扩增文库滴度达到了1×1012,覆盖率达99 %以上,利用该文库筛选得到了紫茎泽兰核酮糖二磷酸羧化酶基因(RuBP)的cDNA片段(GenBank ID:FJ752421),表明文库质量合格。 2.建立了紫茎泽兰的遗传转化体系。通过农杆菌介导的方法建立了紫茎泽兰的遗传转化体系。经过多种检测手段的鉴定,目前已经获得7株转基因植株,转化效率达到2 %。 3.化感相关基因的克隆、筛选及表达谱研究。克隆了4个紫茎泽兰的基因片段,分别是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(HMGS)基因(GenBank ID:FJ913887)、1-去氧木糖-5-磷酸异构酶(DXR)基因(GenBank ID:FJ752422)、倍半萜烯环化酶(TS)基因(GenBank ID:FJ747651)和查尔酮合酶(CHS)基因。荧光定量PCR的结果表明,萜类代谢途径中的两个关键酶基因(HMGS和DXR)的表达水平,没有因为羟基泽兰酮的诱导而表现出显著的差异;CHS基因的表达水平,除了在羟基泽兰酮处理浓度为1.0 mM时的差异不显著之外,在其他处理浓度均有不同程度的下调,说明该基因与化感物质(羟基泽兰酮)的代谢途径相关。 4. EaCHS1基因全长的克隆及表达载体构建。通过RACE技术,首次克隆了紫茎泽兰查尔酮合酶基因的全长(GenBank ID:FJ913888),将其命名为EaCHS1。EaCHS1全长1178 bp,其中5’非翻译区27 bp,3’非翻译区200 bp,最大开放阅读框架948 bp,编码316个氨基酸,理论分子量为33.9 kDa。根据EaCHS1基因的3’非翻译区序列设计引物,进行Real-Time PCR检测,结果发现:经过不同浓度羟基泽兰酮处理,EaCHS1基因的表达水平出现不同程度上调,只在浓度为1.0 mM时的差异不显著。Southern杂交表明,EaCHS1基因在紫茎泽兰中不多于4个拷贝。针对EaCHS1基因构建了植物过量表达载体并利用紫茎泽兰CHS基因的保守序列构建了RNAi载体,分别转化紫茎泽兰和烟草; 5.羟基泽兰酮对植物根系发育的影响。利用模式植物—拟南芥,初步探索了化感物质(羟基泽兰酮)对受体植物根系发育的影响。结果表明:拟南芥根系成熟区的根毛生长在羟基泽兰酮浓度为0.025 mM时,受到促进,而在0.1 mM时开始受到抑制;主根的生长受羟基泽兰酮的影响,存在一个明显的低浓度促进、高浓度抑制的现象。


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