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谷氨酸棒杆菌海藻糖合成相关酶基因的克隆与表达

张文德  
【摘要】: 海藻糖是由两分子的葡萄糖通过α-1,1-糖苷键构成的一种非还原性二糖,广泛存在于细菌、真菌、酵母、昆虫及植物等生物体内。在自然界中海藻糖不仅作为生物体的储备碳源,而且对其在干燥、高温、高盐等胁迫环境下起到重要的保护剂作用。除此之外,海藻糖还可以作为甜味剂、食品干燥和冷冻稳定剂、化妆品保湿剂、组织和器官保护剂等,被广泛应用于食品、医疗和保健等领域。海藻糖最初主要是从植物和酵母中提取,但是这两种制备方法都比较昂贵,目前的研究热点主要集中在寻找简单廉价的海藻糖生产方法方面,利用麦芽寡糖基海藻糖合酶( MTSase )和麦芽寡糖基海藻糖海藻糖基水解酶( MTHase )的协同作用,可以由淀粉直接生产海藻糖。配合其它淀粉水解酶,海藻糖转化率可达80%以上。该方法以淀粉为原料,酶法制备海藻糖,起始物价格低廉,转化率高,为海藻糖的大规模工业化生产提供了可能性。 本实验通过PCR的方法克隆得到谷氨酸棒杆菌的两个海藻糖合成的酶编码基因:麦芽寡糖基海藻糖合酶基因(treY )和麦芽寡糖基海藻糖海藻糖基水解酶基因(treZ ),treY基因长2436bp,编码811个氨基酸,treZ基因长1701bp,编码566个氨基酸。分别构建原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导,MTSase分子量大小约为90 kDa,约占菌体蛋白离心后上清的45.3%;重组MTHase分子量大小约为67 kDa,但大部分目的蛋白是以包涵体形式存在的。分别对两个重组酶的酶学性质进行分析,重组MTSase最适反应温度为35℃,最适反应pH值为8.0,比活力为1588U/mg蛋白,发酵液酶活力达到45.09U/ml,重组酶作用于麦芽糊精,使其DE值降低,得到具有海藻糖末端结构的多聚物;重组MTHase在与重组MTSase共同的作用下可以麦芽糊精为底物产生海藻糖。treY基因和treZ基因经酶切位点改造后,插入到毕氏酵母表达载体pPIC9K后转化毕氏酵母GS115,进行了两基因在毕氏酵母中表达的尝试。


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1 张文德;谷氨酸棒杆菌海藻糖合成相关酶基因的克隆与表达[D];中国农业科学院;2009年
2 沈文;海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及酶学性质分析[D];石河子大学;2006年
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