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《中国农业科学院》 2010年
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陆地棉耐盐相关基因GhVP与GhSAMS的克隆、分析与表达

宋丽艳  
【摘要】: 盐胁迫是自然界主要的非生物胁迫之一。土壤中高浓度的盐离子影响着植物的生长和发育,导致作物大量减产。棉花是较耐盐的作物,盐胁迫下,棉花能够通过自身的调节机制来适应胁迫环境。目前,生产上缺乏有效利用的耐盐品种,因此,挖掘棉花耐盐相关基因,创新棉花种质,为棉花耐盐育种提供材料基础就显得至关重要。本研究选用陆地棉耐盐材料中9835,利用RACE结合RT-PCR技术克隆到H~+-焦磷酸酶基因和S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因,分别命名为GhVP和GhSAMS,并对这两个基因进行序列特征和生物信息学分析;同时,在0.4%的盐量胁迫法处理下,进行了Real-time PCR分析;并构建了原核表达载体,实现了SAMS基因在大肠杆菌中的表达。主要取得的研究进展如下: 1基因克隆与序列特征分析 利用RACE结合RT-PCR技术获得GhVP和GhSAMS基因全长序列,其中GhVP基因cDNA全长2678bp,包括5′-UTR 105bp,完整开放阅读框2301bp和3′-UTR 272bp,编码766个氨基酸的多肽。GhSAMS基因cDNA全长1576bp,包括5′-UTR 117bp,完整开放阅读框1182bp,3′-UTR 250bp,PolyA27bp,编码393个氨基酸的多肽。 2生物信息学分析 生物信息学分析表明,GhVP蛋白与拟南芥、烟草中该蛋白的相似性分别为90%和93%;跨膜预测显示GhVP蛋白含有14个跨膜域,是一个跨膜蛋白;疏水性分析表明GhVP蛋白疏水性较强;进化树分析显示GhVP蛋白与盐生植物盐爪爪、灰绿藜的亲缘关系最近。GhSAMS蛋白与拟南芥、盐地碱蓬、水稻中该蛋白同源性分别为91%、93%、93%;进化树分析显示GhSAMS蛋白与盐地碱蓬的亲缘关系最近;二级结构预测表明,该蛋白是由α-螺旋、β-折叠、转角和无规则卷曲组成;同时,GhSAMS蛋白含有三个保守的功能域。 3 Real-time PCR分析 选取耐盐材料和盐敏感材料在不同盐处理时期的根系,提取RNA,进行Real-time PCR分析。结果表明,盐胁迫下,GhVP和GhSAMS基因在耐盐材料中受到诱导表达,而在盐敏感材料中盐诱导被推迟,推测这两个基因很可能在陆地棉适应盐胁迫过程中发挥重要作用。 4原核表达分析 成功构建了原核表达载体pET28a-GhVP和pET28a-GhSAMS,以大肠杆菌BL21(DE3)为表达菌株进行融合蛋白的诱导表达。GhVP基因在大肠杆菌中没有得到有效表达,改变诱导温度和浓度都没有检测到融合蛋白pET28a-GhVP,初步认为陆地棉GhVP蛋白对大肠杆菌有毒害作用。GhSAMS基因在大肠杆菌中得到了有效表达,检测到了46.6KD的融合蛋白。 盐胁迫下,H~+-PPase通过水解底物PPi为Na~+/H~+逆向转运蛋白提供驱动力,促进Na~+在细胞内的分布,以消除Na~+的毒害;S-腺苷甲硫氨酸能够增加细胞间水分运输,减少根系对离子的吸收,从而整体上提高棉花对盐胁迫的适应性。随着逆境分子细胞生物学的发展,这两个基因的分子功能将得到进一步阐述,其有望成为棉花耐盐种质创新的重要来源。
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