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《中国农业科学院》 2010年
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激发子基因peaT1转化棉花和烟草体系的建立及功能分析

唐宏琨  
【摘要】: PeaT1是来源于极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)的一种蛋白激发子,研究表明PeaT1具有促进植物生长、改善作物品质和诱导植物抗病性等功能。为了实现蛋白激发子PeaT1在棉花和烟草中的表达并进一步研究其功能,本研究建立了激发子基因peaT1棉花和烟草的转化体系,采用分子生物学的方法检测了该基因在受体植株内的整合、转录和表达,并分析了转化株的生长状况和抗病虫性。 本研究获得的主要结果如下: 1.构建了植物表达载体pCAMBIA2300-G4AS-peaT1,该载体含有加倍启动子、多联终止子、切割和加工调控序列等多个表达调控元件,可以提高目的基因的表达水平,通过酶切和测序验证了载体的正确性,可直接用于花粉管通道法转化植物受体,冻融法将该载体成功转化根癌农杆菌LBA4404。 2.建立了蛋白激发子基因peaT1棉花和烟草的转化体系: (1)确立了激发子peaT1叶盘法转化三生烟的培养基体系和培养条件,获得了转基因烟草植株。 (2)比较了不同基因型棉花胚胎发生能力的不同,结果表明,Coker312和CCRI24容易诱导再生,H05、H08和H15胚胎发生比较困难。 (3)通过农杆菌介导法转化棉花下胚轴,筛选了卡那霉素筛选压力、农杆菌侵染浓度和时间、共培养温度和时间、继代方式、防止褐化、激素组合等培养条件,确定了一套适合Coker312和CCRI24再生的培养基体系,得到了卡那霉素抗性的再生棉苗。 (4)通过花粉管通道法转化棉花F15,确定了影响棉花花粉管通道法转化率的关键因素,经过卡那霉素的筛选获得了抗性棉株。 3.通过PCR检测确定了阳性转化株,Southern杂交验证了peaT1基因在烟草和棉花基因组中的整合,RT-PCR验证了peaT1基因的转录,Western杂交验证了peaT1基因在烟草细胞中的表达。 4.分析了棉花和烟草转化株的生长状况,部分peaT1烟草转化株早于其它烟草植株一个月开花,缩短了生长周期;花粉管通道法获得的peaT1转化棉株的茎粗为2.42cm,高于无卡那抗性对照株的平均值1.41,成铃数33个明显高于对照株的平均值8.1个,表明激发子基因peaT1在烟草和棉花中的表达能够促进植物生长。 5.分析了peaT1烟草转化株对TMV的抗性,与非转基因对照烟草相比,T1代转基因烟草株系K1和K2对TMV的枯斑抑制率达到40.86%和46.22%,验证了激发子PeaT1能诱导植物产生抗病性。卷叶螟和棉铃虫的棉花叶片取食试验表明,peaT1棉花转化株表现出一定的抗虫性。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S562;S572

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【参考文献】
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