中生菌素生物合成基因簇克隆及分析

【摘要】： 中生菌素是一种由淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulae var. hainanensis)产生的氨基糖苷类农用抗生素,具有广谱、高效、低毒、无污染等特点,对多种细菌及真菌病害具有良好的防治效果,目前已经得到了广泛的应用。为了利用分子生物学的手段构建高产工程菌,进一步提高中生菌素的生产水平,本研究计划克隆中生菌素生物合成基因簇并对其功能进行分析。 首先以中生菌素产生菌的基因组DNA和粘粒载体pOJ446为材料,构建了基因组粘粒文库。获得的文库覆盖率超过99.99%,可以覆盖淡紫灰链霉菌海南变种B-7基因组10次左右,具有非常高的完整性和代表性。 其次,在文库构建成功之后,确立了一种基于PCR的文库筛选方法。以之前克隆到的中生菌素生物合成基因zpsA片段为筛选目标,对构建的粘粒文库进行基于PCR的筛选。经过5轮共计100多个PCR反应筛选出含有zpsA基因片段的阳性克隆,所有操作耗时15天左右,效率较高。与传统文库筛选方法相比,该方法具有快速、简便、经济、假阳性低且不需要使用同位素等优点。 第三,筛选到阳性克隆后,对筛选到的阳性克隆中DNA插入片段进行测序,最终得到了长为29719 bp的DNA序列,其G+C含量达75.5%,与典型的链霉菌基因组特征相符。 最后,使用DNAMAN、FramePlot 2.3.2、Blast和GeneMark.hmm for Prokaryotes (Version 2.4)等多种生物信息学软件和在线工具对得到的DNA序列进行分析,表明其中含有25个完整的orf。推测其中5个属于ABC类型转运系统;2个编码转录调控因子;15个编码结构基因;2个编码抗性基因;1个为功能未知的基因。其中5个转运基因、2个转录调控因子基因和2个结构基因共9个orf与以往克隆到的链丝菌素生物合成基因没有同源性,属于新的基因。 对25个orf的功能进行了分析。推测5个ABC转运系统orf编码2个ATP结合亚基、2个跨膜亚基、1个PBP2类型的底物结合亚基,从而构成一个完整的ABC转运系统。可推测这一ABC转运系统具有把中生菌素转运出产生菌胞外的功能;推测orf5编码的是GntR家族转录调控因子,ORF5可能与中生菌素产生菌的发育、中生菌素合成或抗性有关,其机理涉及到ABC转运系统与GntR转录调控因子的协同作用;推测orf21和orf24编码中生菌素抗性蛋白。orf21编码氨基糖苷3’-磷酸转移酶。orf24编码链丝菌素乙酰转移酶,对于这种抗性机制已经有了大量报道,并得到了实验验证,因此可以确定其具有中生菌素的抗性功能。15个结构基因orf中有2个是首次在链丝菌素的研究中被克隆到,即orf7和orf25。推测ORF7是参与古洛糖胺进行甲酰胺化的氨基甲酰胺转移酶,ORF25是对链里定进行羟基化修饰的羟化酶。另外,分析认为orf10编码的产物与中生菌素结构中链里定部分的合成有关,而并非以往研究中对于其同源基因sttN所注释的“与古洛糖胺部分的合成有关”。15个结构基因orf中剩余的12个orf与其相应的已经得到克隆的链丝菌素生物合成基因的同源基因的功能相同。 中生菌素生物合成基因簇的成功克隆,以及基因功能的初步推测分析,为中生菌素生物合成基因的功能鉴定及遗传改造奠定了基础。通过对转录调控基因、抗性基因以及结构基因的改造,我们可以达到提高中生菌素产生菌发酵产物中高效组分在混合物中的含量、或是得到仅产某种成分的菌株、或是得到可以产生中生菌素衍生物的菌株等目的。