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大白菜细胞核雄性不育基因的分子标记及定位

张慧  
【摘要】: 大白菜是起源于中国的十字花科芸薹属作物,也是中国及很多其他国家和地区十分重要的蔬菜作物之一。大白菜为典型的异花授粉作物,存在明显的杂种优势。利用自交不亲和系和雄性不育系制种是目前最常用的杂交制种技术。自交不亲和系在利用上存在亲本繁殖困难成本提高、多代自交生活力下降;易受环境影响使杂种纯度不高。利用雄性不育系制种是一种理想的杂种生产模式。雄性不育系又被分为细胞质雄性不育系和细胞核雄性不育系。细胞核雄性不育系不育性完全,不会影响植株生活力。目前,对大白菜细胞核雄性不育的遗传解释存在多种遗传模式,不同遗传模式将直接影响雄性不育的转育。同时,利用分子标记方法对不育基因和恢复基因的研究较为初步。 本研究对两个隐性细胞核雄性不育系(452AB和454AB)和一个显性细胞核雄性不育系(451AB)进行了遗传学研究,判断不育系的遗传模式,不育基因在自交系中的分布,并对三个不育系的育性恢复基因和不育基因进行了分子标记、基因定位。主要结果如下: 1.隐性雄性不育系452AB和454AB的可育株和不育株分别与显性雄性不育系451AB中的可育株杂交,并进一步回交。通过数据分析推断451AB系不育基因与454AB系恢复基因为等位基因,这两个系属于复等位遗传模式。452AB系与另外两个系不同,表现为独立遗传。三个不育系与17个自交系进行测交,判断自交系基因型。根据测交结果,4个自交系的可育基因对452AB系不育基因有保持作用。进一步研究判断452AB系也为一复等位雄性不育系。两复等位雄性不育系在基因组中的位置不同,并不存在关联。 2.隐性细胞核雄性不育系452AB包含164个单株。利用混合分组分离法(BSA)对不育系进行标记分析,并优化SRAP反应体系。在构建的基因池中筛选SRAP引物1 256对,SSR引物187对。获得与大白菜隐性细胞核雄性不育系恢复基因(BrMsf2)连锁的标记两个,PM8K4和Me2M49,与恢复基因的遗传距离分别为2.98 cM和10.92 cM。通过调查PM8K4标记在大白菜DH作图群体中的多态性,将该恢复基因定位在大白菜染色体A08。根据大白菜基因组测序信息,筛选来自染色体A08候选区域的Indel标记23个,其中scaffold20上的标记S20-1与恢复基因的遗传距离为4.22 cM。通过S20-1和PM8K4标记在染色体上的位置,将BrMsf2定位在scaffold20的附近。 3.显性细胞核雄性不育系451AB包含480个单株。利用混合分组分离法、SRAP和SSR标记技术筛选与不育基因BrMs1连锁的标记。在1 378对SRAP标记和238对SSR标记中,筛选到与不育基因连锁的SRAP标记5个(CuMe7BEm12, BMe9E32, PM8E38, E35BEm10, and M51K2),SSR标记1个(ENA6)。其中PM8E38标记与不育基因的距离最近,为0.37 cM。将该标记多态性片段进行克隆测序,成功的转化为较为简易的SCAR标记PM8E38S。通过SSR标记ENA6在DH作图群体中的位置,不育基因BrMs1被定位在大白菜染色体A07上。 4.利用2357个单株对451AB系不育基因进行精细定位。初步定位标记PM8E38S在精细定位群体中与不育基因的遗传距离为0.59cM。将初步定位标记的序列与基因组序列进行比对,没有比对在染色体A07上。筛选根据白菜基因组序列设计的内含子多态性(Intron Polymorphism,IP)标记13对,与芥菜中设计的IP标记28对,筛选到一个与不育基因距离较远的标记A0703-2。设计开发基于测序技术的酶切标签标记,并首次应用于雄性不育基因的精细定位中。筛选酶切标签标记76个,获得4个基因组位置已知的标记S17-52、S1727-5、S1727-6、S1729-5和6个基因组位置未知的标记SNONE-2、SNONE-7、SNONE-9,SNONE-16,SNONE-27和SNONE-44,其中SNONE-9与不育基因遗传距离最小(0.51 cM)。S1727-6是与不育基因距离最短(0.76 cM)的位置已知的标记。进一步对该区域Indel标记进行筛选,从26对引物中,筛选到4对存在多态性的Indel标记(S17-1、S17-2、S69-1和S69-2)。通过Indel标记以及酶切标签标记在基因组中的位置,将标记与基因之间的遗传距离与物理距离想对应。通过基因所在区域序列分析结果,预测该基因位于重复序列较多的中心粒区。 5. 454AB系为隐性细胞核雄性不育系,它包含320个单株。利用混合分组分离法根据育性构建育性池。筛选SRAP标记1 128个,SSR标记187个。筛选出与恢复基因BrMsf3连锁的SRAP标记两个,BMe10SA4和M52K2,与恢复基因的连锁距离为4.38 cM和7.46 cM,这两个标记位于基因的同侧; SSR标记ENA6与恢复基因的遗传连锁距离为11.57cM。通过ENA6标记在DH作图群体中的位置,将该恢复基因定位在大白菜染色体A07上。进一步筛选位于A07上的Indel标记26个,酶切标签标记65个,未发现与恢复基因(BrMsf3)连锁的标记。基因定位结果证实了451AB系和454AB系的复等位遗传关系。 6.通过遗传学分析和基因定位结果,得到451AB系和454AB系属于复等位遗传,不育基因位于染色体A07上,452AB系属于复等位遗传,不育基因位于染色体A08上,证明大白菜中存在一个以上复等位雄性不育系统。


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