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《中国农业科学院》 2010年
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产气荚膜梭菌的分子诊断与免疫研究

王光华  
【摘要】: 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens),是一种革兰氏阳性、产芽孢、杆状厌氧菌,广泛分布于自然界和多种动物肠道内,在一定条件下,可引家畜、野生动物和人类的多种疾病。该菌按照产生的毒素不同可分为五种血清型(A、B、C、D和E型)。由于该菌的致病性与其产生的毒素有关,因此按照细菌产生的主要毒素进行定型,对本病的诊断和流行病学监测就显得非常重要。本研究通过显微镜观察、血清中和试验、生化试验和PCR方法分离和鉴定了一株家畜体内的产气荚膜梭菌;建立了检测产气荚膜梭菌毒素的多重PCR诊断方法、荧光定量多重PCR方法和单克隆抗体夹心ELISA方法;其中用荧光定量PCR方法从家畜粪样中直接检测梭菌毒素,在国内尚属首次。另外,通过寡核苷酸介导的突变方法,在国内首次构建了产气荚膜梭菌ε毒素的一个无细胞毒性突变体,并用该突变体蛋白做了小鼠免疫保护试验。研究结果如下: (1)从宁夏某奶牛场急性死亡的奶牛组织和肠道中分离出一株细菌,该菌在厌氧条件下生长迅速,产酸产气:在鲜血琼脂平板培养基上,菌落为圆形、扁平光滑、边缘呈锯齿状以及周围有双溶血环。经生化试验、小鼠血清中和试验以及PCR检测最终鉴定为A型产气荚膜梭菌,并且将α毒素进行了克隆表达。 (2)建立了多重PCR检测产气荚膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因的检测方法,该方法具有良好的特异性和敏感性,用本方法检测多种细菌,只有产气荚膜梭菌呈现阳性反应,而其它梭菌以及大肠杆菌、葡萄球菌均为阴性;将目标菌的肉汤培养液样品10倍系列稀释后进行检测,检测灵敏度达到1.2×103 CFU/mL.用该方法可以检测动物粪便样品和肠内容物中的产气荚膜梭菌并直接确定其血清型,为产气荚膜梭菌临床诊断和分子流行病学调查提供了可靠的技术。 (3)试验中制备了三株分泌抗产气荚膜梭菌a毒素的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5A4、3H4和5H4,对它们的部分特性进行了鉴定,单抗亚型鉴定结果显示5A4、3H4和5H4抗体亚型分别为IgG1、IgG1和IgG2a。杂交瘤细胞经小鼠多次传代后进行效价检测,结果三株单抗都具有很好的稳定性。用5A4初步建立了单抗夹心ELISA方法,为产气荚膜梭菌a毒素的大量检测奠定了基础。 (4)参考发表的序列建立了检测产气荚膜梭菌毒素基因的荧光定量多重PCR方法,该方法可直接从动物粪样中检测目标菌的毒素基因并对目标菌定型。在实验室对宁夏地区三个奶牛场采集的261份粪样用本方法检测。结果发现,261份样品中有176份样品存在产气荚膜梭菌毒素基因,根据毒素分型规则判断只有A型和D型产气荚膜梭菌,在176份阳性样品中有142份样品中含有cpb2基因,占总数的80.7%。利用荧光定量多重PCR方法对奶牛粪样中产气荚膜梭菌分子进行定型,这在我国是首次报道。 (5)实验中克隆和表达了D型产气荚膜梭菌e毒素基因,并且采用寡核苷酸介导的突变方法,在国内首次构建了产气荚膜梭菌e毒素的一个突变体,突变体蛋白能在大肠杆菌(Rosseta)中获得表达,并且表达的蛋白能够被天然e毒素抗体所识别。用体外MDCK细胞分析法检测了此突变体蛋白的细胞毒性,结果表明,当e毒素蛋白第106位的组氨酸突变为脯氨酸后毒素蛋白的细胞毒性丧失,用此蛋白免疫小鼠后能产生特异性抗体,并且免疫小鼠能够抵抗1000LD50剂量的野生型e毒素攻击。该实验为进一步研究D型产气荚膜梭菌e毒素结构与功能的关系以及研制预防动物肠毒血症的基因工程疫苗奠定了基础。
【学位授予单位】:中国农业科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S855

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 王璞;产气荚膜梭菌与化脓隐秘杆菌二联灭活疫苗的制备及体液免疫效果评价[D];东北农业大学;2013年
【参考文献】
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1 马同锁,张燕,刘宏博,赵宝华;腐败梭菌的培养方式及生化特性鉴定[J];河北师范大学学报;2005年05期
2 吕存女,张敬友,赵红,傅思武,孟筱琦;微量法测定产气荚膜梭菌α毒素[J];兰州大学学报;2000年06期
3 徐一鸣;金宁一;夏志平;马鸣潇;鲁会军;韩松;金扩世;梁国栋;;禽流感病毒H5HA、H7HA、H9HA亚型血凝素基因在毕赤酵母中的表达[J];生物工程学报;2006年02期
4 柴同杰,张绍学,常维山,侯彦平,姜世金,WolfgangMueller;ELISA对动物舍气载魏氏梭菌型别的研究[J];畜牧兽医学报;2001年01期
5 文其乙,刘秀梵,Werner Phillip,Reinhard Boehm;多重聚合酶链反应检测环境中产气荚膜杆菌[J];畜牧兽医学报;2002年06期
6 张小荣,文其乙,刘秀梵,焦新安;应用多重PCR快速诊断山羊猝死症的研究[J];中国兽医科技;2002年03期
7 金鑫;李云霄;张营;单雪梅;于丹;任春雨;;牛D型产气荚膜梭菌肠毒血症间接ELISA诊断方法的建立[J];中国兽医科学;2008年04期
8 王克领,杜全德,郭秀琦;兔出血症-魏氏梭菌病-巴氏杆菌病三联苗的研究与应用[J];中国养兔杂志;1998年03期
9 王海荣,唐德宏,鹿道新,樊丽,柴同杰;畜舍环境中魏氏梭菌分离及基因型鉴定[J];中国人兽共患病杂志;2005年11期
10 柴同杰,刘文波;魏氏梭菌毒素疫苗研制及其免疫家兔抗体消长规律[J];中国兽医学报;2005年03期
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 梁光军;应用多重PCR方法鉴定粪样和食品中产气荚膜梭菌及肠毒素阳性产气荚膜梭菌的基因型鉴定[D];扬州大学;2004年
2 赵立峰;鹿出血性肠炎疫苗研制及魏氏梭菌β毒素基因序列分析[D];山西农业大学;2005年
【共引文献】
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1 邹励丹;彭远义;彭涛;;鸡葡萄球菌病诊治一例[J];安徽农学通报;2007年17期
2 倪莉;王豪举;程光胜;刘华栋;;肉鸡鸡毒支原体和大肠杆菌混合感染的诊治[J];安徽农学通报(上半月刊);2009年17期
3 蒋建军,王鹏雁,剡根强,康立超;集约化兔场高致病性痢疾志贺菌的分离与鉴定[J];安徽农业科学;2005年09期
4 王天有;赵恒章;;家兔附红细胞体病的诊断与治疗[J];安徽农业科学;2005年11期
5 王天有;秦操;;羊快疫的诊断与防制[J];安徽农业科学;2005年12期
6 王丽荣;董永军;梁美兰;;牛病毒性腹泻病毒的病原学与诊治[J];安徽农业科学;2005年12期
7 王天有;赵恒章;;附红细胞体病病原学诊断方法的研究[J];安徽农业科学;2006年01期
8 王天有;尚伟杰;黄秋玲;王相如;;猪附红细胞体病继发猪瘟的诊断与治疗[J];安徽农业科学;2006年10期
9 王相如;尚伟杰;游鸿垒;;猪附红细胞体病继发猪肺疫的诊断与防治[J];安徽农业科学;2006年14期
10 李军民;靳二辉;时红攀;;犬瘟热的诊治[J];安徽农业科学;2006年15期
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1 陈珍;万春和;曾亮明;朱春华;林甦;刘斌琼;林羽;黄瑜;;H9N2亚型禽流感安徽分离株CK/AH/1/10的分子特征[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
2 毛立;李文良;严少华;钟声;郭俊尧;江杰元;;山羊流产病料中牛病毒性腹泻病毒的检测[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
3 刘洋;布日额;吴金花;郭闯;锡林高娃;刘燕;;内蒙古中东部地区乳源性大肠杆菌PCR检测及其耐药性分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
4 徐慧;韦莉;佟瑞平;龚玉梅;王宏俊;孙惠玲;张培君;;溶血性曼氏杆菌PCR诊断试剂盒的研究[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
5 李喜旺;董奎龙;彭玉伟;;中药“牛孕灵”冲剂治疗奶牛不孕症的临床疗效总结[A];中国奶业协会年会论文集2008(上册)[C];2008年
6 邬纯鸿;黄毅;王文莉;钟代彬;吴广安;方艳军;;现代化奶牛场乳房炎病因调查及其防治[A];中国奶业协会年会论文集2009(上册)[C];2009年
7 葛文霞;柳旭伟;张旭峰;;克拉玛依市农业开发区H5亚型禽流感免疫抗体水平的检测[A];2010植物提取物与营养及应用技术交流研讨会论文集[C];2010年
8 孔繁德;王荣;陈琼;吴德峰;徐淑菲;;多重RT-PCR一步法技术同时检测猪瘟病毒和蓝耳病病毒方法的建立以及初步应用[A];第十届中国科协年会论文集(三)[C];2008年
9 郭延军;;猪附红细胞体病合并猪瘟的诊治与体[A];濮阳市首届学术年会论文选编[C];2006年
10 郭延军;王宏伟;;一野兔饲养场野兔死亡的诊治报告[A];濮阳市首届学术年会论文选编[C];2006年
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1 姚美玲;H9N2亚型禽流感病毒气溶胶发生与传染机制及其感染SPF鸡的特点[D];山东农业大学;2010年
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3 黎满香;感染猪的粪肠球菌的分离鉴定及部分特性和诊断方法研究[D];湖南农业大学;2010年
4 闫振贵;不同途径免疫NDV弱毒苗诱导鸡体黏膜和系统免疫反应的研究[D];山东农业大学;2011年
5 李素;猪瘟病毒感染血管内皮细胞的差异蛋白质及细胞因子表达变化分析[D];吉林大学;2011年
6 季华员;猪产肠毒素型大肠杆菌F41受体基因的精细定位与鉴别[D];江西农业大学;2011年
7 羊云飞;牦牛、牧民源大肠杆菌分离鉴定、耐药基因检测、PFGE分析及耐药性传递的研究[D];四川农业大学;2011年
8 邹成义;恩拉霉素对断奶仔猪生产性能和免疫功能的影响及机制研究[D];四川农业大学;2011年
9 齐莎日娜;猪β-防御素基因表达特点及精氨酸的调节作用[D];四川农业大学;2010年
10 张春辉;致病性大肠埃希菌ESBLs的基因检测与耐药性控制[D];西北农林科技大学;2011年
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3 段龙川;产毒素多杀性巴氏杆菌重组沙门氏菌基因工程疫苗的研究[D];华中农业大学;2010年
4 刘新军;表达布氏杆菌sodc基因的重组沙门氏菌的构建及不同种布氏杆菌鉴别PCR检测方法的建立[D];华中农业大学;2010年
5 王延昭;利用免疫磁珠技术富集肠炎沙门氏菌和金黄色葡萄球菌[D];华中农业大学;2010年
6 严琦;副猪嗜血杆菌与巨噬细胞相互作用的初步研究[D];华中农业大学;2010年
7 徐珊珊;重组杆状病毒介导的高致病性猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗研究[D];华中农业大学;2010年
8 王艳伟;PRRSV感染激活RANTES产生的信号通路研究[D];华中农业大学;2010年
9 崔翔;动物可食组织中安眠酮残留的ELISA检测方法研究[D];华中农业大学;2010年
10 王秀云;鸡传染性法氏囊病病毒山东株的分离鉴定及免疫预防研究[D];山东农业大学;2009年
【同被引文献】
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1 李云霄;金鑫;张营;单雪梅;于丹;;魏氏梭菌病诊断方法研究进展[J];动物医学进展;2007年07期
2 张红英,卢中华,杨霞,王亚宾,金钺;我国魏氏梭菌病的流行特点[J];中国畜牧兽医;2004年01期
3 鲁杏华;何世成;谈志祥;刘道新;邱立新;范仲鑫;唐小明;黄建龙;王洪冰;;猪化脓隐秘杆菌的分离与鉴定[J];中国畜牧兽医;2009年05期
4 吴忆春;;兔产气荚膜梭菌SD12株的分离与血清型鉴定[J];中国畜牧兽医;2013年03期
5 赵敬翠;李杰;刘耀川;刘明春;;化脓隐秘杆菌的特性及化脓隐秘杆菌病的防治[J];黑龙江畜牧兽医;2009年11期
6 王冬梅;宋春杰;;成年奶牛产气荚膜梭菌肠毒血症的防治[J];黑龙江畜牧兽医;2012年10期
7 王密;周玉龙;朴范泽;;牛化脓性隐秘杆菌病PCR诊断方法的建立[J];微生物学通报;2010年09期
8 刘明春;杨蕴力;吴聪明;沈建忠;;奶牛子宫内膜炎化脓隐秘杆菌的分离与PCR鉴定[J];畜牧与兽医;2008年11期
9 邱慧玲;陈甫;费荣梅;唐名艳;;麋鹿产气荚膜梭菌分离鉴定方法的建立与初步应用[J];畜牧与兽医;2011年10期
10 德艳艳;姜志刚;牛思博;孙刚;于力;;携带非典型cpb2基因牛源A型产气荚膜梭菌重组α毒素的免疫保护性研究[J];中国预防兽医学报;2012年07期
中国硕士学位论文全文数据库 前4条
1 徐为中;兔病毒性出血症、多杀性巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病(A)型三联灭活疫苗的研制[D];南京农业大学;2005年
2 施远翔;喀什地区疏附县牛猝死症病原分离与鉴定[D];新疆农业大学;2006年
3 周永银;兔产气荚膜梭菌病、大肠杆菌病病原的分离鉴定及其二联油乳剂灭活疫苗的研制[D];南京农业大学;2007年
4 冯峰;山羊化脓隐秘杆菌的分离鉴定及其对小鼠的致病性试验[D];四川农业大学;2010年
【二级参考文献】
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1 贾英;兔魏氏梭菌病的诊治[J];山东畜牧兽医;1998年04期
2 张明智;家兔A型魏氏梭菌病的诊疗报告[J];当代畜牧;1999年02期
3 文其乙;产气荚膜梭菌肠毒素的致病机理研究进展[J];动物医学进展;2002年02期
4 吴庆儒;郭定宗;张桂荣;李文波;;BSA对牛结核抗体ELISA检测的影响[J];动物医学进展;2007年05期
5 李云霄;金鑫;张营;单雪梅;于丹;;魏氏梭菌病诊断方法研究进展[J];动物医学进展;2007年07期
6 张红英,卢中华,杨霞,王亚宾,金钺;我国魏氏梭菌病的流行特点[J];中国畜牧兽医;2004年01期
7 任世俨,李维洁,蒋士增;梅花鹿肠毒血症的诊治[J];甘肃畜牧兽医;1997年02期
8 任世俨;平凉地区牛猝死症调查[J];甘肃畜牧兽医;1998年03期
9 刘棋,郭建刚,黄夏,覃芳芸,胡杰,陆文俊;广西家畜猝死症病因调查报告[J];广西农业科学;2001年05期
10 徐彤;梅花鹿魏氏梭菌肠毒血症诊断报告[J];黑龙江畜牧兽医;1999年03期
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1 刘棋,胡杰,郭建刚;猪产气荚膜梭菌病的诊断[J];中国兽医科技;2001年05期
2 陈兴祥,薛家宾,黄克和,王启明,徐为中;A型产气荚膜梭菌α毒素的提纯试验[J];畜牧与兽医;2002年03期
3 文明,王松林,李绍荣,孟艳;鲜猪肉中A型产气荚膜梭菌污染情况调查[J];中国兽医科技;2002年12期
4 文其乙,刘秀梵;多重PCR方法快速检测粪样中产气荚膜梭菌[J];中国预防兽医学报;2002年01期
5 文明,王开功;几种分离产气荚膜梭菌培养基的比较[J];中国兽医杂志;2002年12期
6 王开功,文明,周碧君,孔令萍;A型产气荚膜梭菌最佳产毒时间的确定[J];中国兽医科技;2003年08期
7 梁源祥,李会创,冼恩广,李布勇;牛产气荚膜梭菌的分离与鉴定[J];中国兽医科技;2004年05期
8 赵志军,许崇波,曾瑾,王玉炯;A型产气荚膜梭菌α毒素基因的高效表达[J];生物技术;2004年05期
9 赵立峰,任家琰;产气荚膜梭菌α毒素的研究进展[J];经济动物学报;2004年04期
10 刘家森,刘怀然,陈洪岩,李一经;产气荚膜梭菌α毒素研究进展[J];中国兽医杂志;2005年05期
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1 王海荣;吕长辉;赵凯;柴同杰;陆承平;;山东省兔腹泻病例产气荚膜梭菌的分离及基因定型[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会论文集[C];2012年
2 么宏强;苏佳;于立新;马学恩;;A型产气荚膜梭菌α毒素的提纯鉴定及其基因的克隆[A];2012年中国畜牧兽医学会兽医病理学分会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会学术研讨会论文集[C];2012年
3 田冬青;蒋玉文;陈小云;杨京岚;丁家波;;产气荚膜梭菌多重PCR定型方法的建立[A];中国畜牧兽医学会2006学术年会论文集(下册)[C];2006年
4 李娜;吴建勇;李建军;杨学云;王登峰;段新华;王治才;;D型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与高效表达[A];生态环境与畜牧业可持续发展学术研讨会暨中国畜牧兽医学会2012年学术年会和第七届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会会议论文集——T07家畜微生态与健康养殖专题[C];2012年
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6 王光华;周继章;蔺国珍;郑福英;曹小安;韩文祥;杨良存;宋竹青;邱昌庆;;产气荚膜梭菌青海分离株α毒素基因克隆与核苷酸序列分析[A];第九届中国生物毒素学术研讨会论文摘要[C];2009年
7 梁光军;赵李祥;杨旭芹;贾红;张小荣;文其乙;刘秀梵;;应用多重PCR方法鉴定粪样和食品中产气荚膜梭菌[A];人畜共患传染病防治研究新成果汇编[C];2004年
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10 李洁萍;倪学勤;曾东;刘丽达;魏豪;;体外筛选拮抗产气荚膜梭菌的鸡源乳酸杆菌[A];第四届第十次全国学术研讨会暨动物微生态企业发展战略论坛论文集(上册)[C];2010年
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1 王光华;产气荚膜梭菌的分子诊断与免疫研究[D];中国农业科学院;2010年
2 蔡玉梅;山东省四大湖(库)淡水鱼产气荚膜梭菌毒素型调查及致病机理研究[D];山东农业大学;2008年
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1 梁光军;应用多重PCR方法鉴定粪样和食品中产气荚膜梭菌及肠毒素阳性产气荚膜梭菌的基因型鉴定[D];扬州大学;2004年
2 刘家森;兔产气荚膜梭菌(A型)α毒素原核表达产物免疫原性分析[D];东北农业大学;2004年
3 王超;产气荚膜梭菌ε毒素突变基因重组乳酸杆菌的构建及其免疫学评价[D];东北农业大学;2012年
4 田冬青;产气荚膜梭菌的多重PCR定型及α、β和ε毒素基因的克隆、表达和抗血清的制备[D];中国兽医药品监察所;2007年
5 邱慧玲;麋鹿产气荚膜梭菌病的流行病学调查[D];南京农业大学;2012年
6 李娜;羊源产气荚膜梭菌的分离鉴定与α毒素的原核表达和免疫原性研究[D];石河子大学;2013年
7 尹辉;牛产气荚膜梭菌α-ε融合基因的构建、表达及免疫原性研究[D];黑龙江八一农垦大学;2014年
8 李晓静;产气荚膜梭菌α毒素重组干酪乳杆菌表达及其免疫学分析[D];东北农业大学;2009年
9 郑晓丽;规模化鸡场健康鸡群产气荚膜梭菌的分离、鉴定及遗传多样性研究[D];四川农业大学;2009年
10 王苗利;产气荚膜梭菌α毒素蛋白在感染小鼠器官分布的检测[D];山东农业大学;2011年
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