精氨酸和亮氨酸促进狂犬病病毒增殖及抗原纯化工艺的研究

【摘要】： 为提高狂犬病病毒在细胞培养中的滴度及灭活疫苗的免疫效力,本课题对精氨酸和亮氨酸促进狂犬病病毒增殖及抗原纯化工艺进行了研究。结果表明,1.2mmol/L精氨酸、0.8mmol/L亮氨酸提高狂犬病病毒滴度分别为0.68㏒LD50/0.03ml、0.53㏒LD50/0.03ml,与对照组差异显著(P0.05)。通过葡萄糖、氨和乳酸浓度检测证明,添加精氨酸和亮氨酸对细胞代谢无影响。精氨酸组病毒培养24h、48h、72h和96h时,NO浓度比对照组分别提高了3.09、3.97、10.8和7.54μmol/L,两者差异显著(P0.05),而亮氨酸组与对照组无明显差异。经多克隆荧光抗体染色结果表明,与对照组相比,精氨酸和亮氨酸组病毒吸附由60min缩短为30min,病毒穿膜由90min缩短为60min;经核蛋白单克隆荧光抗体染色结果表明,病毒核蛋白合成由21h缩短为18h;经狂犬病病毒抗原检测试剂盒检测培养液,病毒阳性检出由54h提前到42h。 建立了狂犬病病毒荧光定量检测方法(RV FQ-PCR),通过对细胞培养中狂犬病病毒糖蛋白基因表达水平的检测结果表明,添加精氨酸和亮氨酸后24h、48h、72h和96h时糖蛋白基因表达水平分别为对照组的5.16、7.36、8.91、7.50倍和2.87、6.13、6.9、5.01倍;与常规PCR、荧光抗体法(FAT)和小鼠脑内接种法(MIT)进行小鼠和犬脑组织中人工感染狂犬病病毒检测的比较,FQ-PCR方法检测灵敏度分别为常规PCR、FAT和MIT的10、100和1000倍。 通过浓缩方法的筛选和凝胶纯化方法的比较结果证明,应用超滤膜堆对狂犬病病毒液进行50~60倍浓缩,采用Sepharose 4 FastFlow凝胶进行纯化,杂蛋白去除率在99%以上,抗原回收率在77%以上,抗原比活性提高25.59倍。此工艺可线性放大,操作简便,适合于工业化生产。