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《中国林业科学研究院》 2012年
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日本落叶松实生苗small RNA测序、microRNA鉴定及其目标基因差异表达分析

吴涛  
【摘要】:日本落叶松(Larix leptolepis)是我国北方重要的针叶速生用材造林树种,已经在选择育种和杂交育种等方面取得重要进展,然而仍不能满足发展林木良种、提高林木产量、增强落叶松生产力的重大需求。究其原因,除背景复杂、生长周期长等特有问题外,我国针叶树基础理论与分子遗传研究基础薄弱也是导致落叶松改良进程缓慢的原因之一。新型的microRNA(miRNA)在生物生长发育过程中发挥关键调控作用,是农艺性状关键调控因子,正作为手段运用于品种遗传改良研究。本研究以2年生日本落叶松实生苗根、茎、叶总RNA等量混合样品构建small RNA(sRNA)文库,利用Solexa测序平台,结合生物信息学方法筛选调控落叶松生长发育过程的miRNAs;通过psRNATarget软件在线预测miRNAs目标基因;采用qRT-PCR技术研究种子萌发不同时期的种胚(0d、1d、5d、9d、28d)、植株生长不同时期的针叶及茎(90d、1.5a、5a、10a、25a和50a)中miRNA的差异表达及5′RACE技术验证3个目标基因的切割位点。研究结果如下: (1)利用Illumina GAIIx平台进行sRNA库Solexa测序并筛选出候选miRNAs。获得27,042,027条原始序列,经去噪、除杂,获得长度范围在16nt~26nt的待分析序列7,466,370条,测序数据已提交至NCBI-Gene Expression Omnibus (GEO)数据库,登录号为GSE34805。21nt长度的序列占sRNA的48.39%,表明落叶松sRNA以21nt长度序列为主要类型;将待分析序列与miRBase (17.0)及本室落叶松转录组数据进行BLAST序列比对,获得308个候选miRNAs。Solexa技术成功获得大量针叶树候选miRNAs序列。 (2)利用BLAST比对及二级结构预测鉴定出85个家族的174个miRNAs。77个miRNAs(61.04%为21nt;66.23%以U为5′端首位碱基)属于48个保守家族,占所鉴定的miRNA基因家族总数的56.47%;97个miRNAs属于37个新发现的基因家族(74.23%为21nt;48.45%以U为5′端首位碱基)。48个保守miRNAs基因中有20个是陆地植物共同保守的(miR156、miR159、miR160、miR162、miR164、miR166~miR169、miR171、miR172、miR390、miR393~miR399和miR408),12个miRNAs仅在针叶树种中特异表达(miR946、miR947、miR950、miR951、miR1311~miR1314、miR1316、miR3697、miR3701和miR3707)。利用qRT-PCR方法对34个保守的和6个新发现的miRNAs进行了表达验证。研究发现和鉴定的miRNA基因,拓宽了我们对针叶树miRNA的认识并极大地丰富了其信息资源。 (3)利用生物信息学手段预测、分析出236个miRNA目标基因。psRNATarget软件预测目标基因及GO蛋白功能注释结果表明,日本落叶松85个miRNA基因家族的236个目标基因主要参与转录调控、生长发育、蛋白转运、胁迫响应、激素信号传导及电子传递等生物过程。 (4)29个miRNAs在种子萌发前期总体呈下降趋势、8个miRNAs在植株生长过程中随植株年龄增加呈规律性表达变化模式。运用qRT-PCR方法分析了miR156等29个miRNAs在日本落叶松种子萌发过程5个关键时期(0d、1d、5d、9d和28d)和植株生长6个时期(90d、1.5a、5a、10a、25a和50a)的表达变化模式。结果显示,miRNAs的表达水平在成熟种子(0d)中最高,吸胀(1d)和萌动(5d)阶段迅速下降,44.83%(13/29)的miRNAs总体呈逐渐降低趋势;种子萌发各个时期,miR894的相对表达量最高,miR408最低。8个miRNAs (miR156、miR172、miR395、miR396、miR397、miR398、miR408和miR947)随年龄增长呈现出规律性上升或下降趋势。5a和25a是许多miRNAs表达变化的转折点,可能是miRNA调控落叶松生长发育的关键时期。研究揭示了在种子萌发和植株生长过程中,miRNAs的差异表达特性可能对落叶松生长发育起着重要调控作用。 (5) APm、EF1和eIF三个适合目标基因qRT-PCR定量研究的内参基因的筛选。利用geNorm和NormFinder两种分析软件对12个候选内参基因的稳定性进行评价,并从中筛选出在落叶松不同器官、不同生长发育时期(体细胞胚胎原胚团时期到胚胎成熟时期、种子萌发过程、植株幼年生长阶段到成年生长阶段)表达稳定的APm、EF1和eIF三个内参基因。为落叶松miRNA目标基因的qRT-PCR表达分析提供最适内参。 (6)落叶松针叶中miR172与其目标基因AP2L1的表达变化在植株生长过程中呈显著负调控关系(r=–0.960,P=0.002)。miR172、miR397和miR398分别切割其目标基因AP2L1、JR147962(Laccase)和JR143920(Phytocyanin)的mRNA,切割位点位于miRNA与其目标基因互补序列第10和11位碱基之间。miR397、miR398与其目标基因JR147962(Laccase)、JR143920(Phytocyanin)之间的表达变化未发现明显相关性。 上述研究表明,来自85个家族的174个miRNAs中,有8个miRNAs在落叶松的生长发育过程中可能具有重要调控作用。miR172在植株生长过程中与其目标基因AP2L1呈现显著的负相关性。AP2L1作为一种重要的调控日本落叶松植株个体发育过程的功能分子展开研究极具价值。为进一步研究针叶树miRNAs在生长发育过程中的作用及人工定向遗传改良的分子调控机制提供依据。
【学位授予单位】:中国林业科学研究院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:S791.223

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