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植原体tuf基因启动子分子特征和枣树抗植原体物质研究

于少帅  
【摘要】:植原体是一类引起众多植物病害、无细胞壁、不能分离培养的原核微生物,其寄主种类多,危害面积广,对经济和环境等影响严重。由植原体引起的泡桐丛枝病、枣疯病、苦楝丛枝病、桑萎缩病、莴苣黄化病等是我国泡桐、枣树等植物的一类毁灭性的病害,因此,从病原微生物遗传多样性、系统进化、关键基因调控、寄主抗病物质分析等角度来研究植原体生长繁殖和遗传变异机制及其与寄主之间的互作关系有助于解决相关病害研究的基础理论问题和提高病害防治水平,对于保障农林业的健康发展具有较为重要的生态意义和经济价值。本研究选用植原体的rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fusA,gyrB,pyrG和rpoB共10个持家基因序列,结合16S rDNA序列,以全基因组序列已完成的洋葱黄化植原体(OY-M)、翠菊黄化丛枝植原体(AYWB)、澳大利亚葡萄黄化植原体(CPA)、草莓致死黄化植原体(SLY)和苹果簇生植原体(CPM)共5种植原体株系为参照,分析来自我国10个省的苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、泡桐丛枝和长春花绿变植原体共18个株系的遗传变异规律和系统发育关系,通过多重序列比对分析不同基因片段的序列多态性和变异程度。研究结果表明:我国18株苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、泡桐丛枝和长春花绿变植原体株系的rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fusA,gyrB,pyrG和rpoB多位点序列共有15种序列类型,揭示了16SrI组不同植原体株系间丰富的遗传多样性。基于rp等10个基因多位点序列分析可将16SrI-B、D亚组的不同植原体株系清晰的分开。10株苦楝丛枝植原体株系与2株桑萎缩植原体株系统发育关系最近,多位点序列分析可将这两种基于16S rDNA序列难以区分的植原体株系加以清晰的区分。10株来自我国不同地区的苦楝丛枝植原体株系分为4个进化枝,其多位点序列存在8种序列类型,这4个分枝与植原体株系的地理分布关系密切。与我国长春花绿变和泡桐丛枝植原体株系相比,福建三明2株莴苣黄化植原体株系与日本洋葱黄化植原体株系OY-M系统发育关系较近。在已检测分析的植原体不同基因序列片段中,dnaK基因序列片段的变异水平最高。利用热不对称交错式PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)扩增枣疯植原体(JWB)tuf基因上游未知序列,利用启动子探针载体pSUPV4成功构建了泡桐丛枝植原体(pawb)和jwbtuf基因上游序列的大肠杆菌异源表达体系,分析、验证了pawb、苦楝丛枝(cwb)、莴苣黄化(ly)、桑萎缩(md)、长春花绿变(pev)等16sri组和jwb、樱桃致死黄化(cly)、重阳木丛枝(biwb)、黄金槐丛枝(sowb)等16srv组株系tuf基因上游序列的遗传变异特征和启动子活性。研究结果表明:泡桐丛枝等16sri组植原体株系tuf基因和其上游fusa基因之间的间区序列长129-130bp,预测有完整的启动子保守结构。pawb-sdyz、ly-fjya1、pawb-fjfz株系tuf基因上游130bp片段和cwb-hnsy1株系tuf基因上游129bp片段具有启动子活性,此间区序列在5种35株16sri组株系中存在4种变异类型;枣疯病植原体等16srv组株系fusa和tuf基因间区长53-54bp,未预测到完整启动子结构。jwb-jsnj株系tuf基因上游144和346bp片段,jwb-hnpy株系tuf基因上游145和347bp片段均未检测到启动子活性,fusa和tuf基因间区序列在4种21株16srv组株系中存在2种变异类型。fusa-tuf基因间区序列相对保守,基于此序列构建的进化树可清晰区分不同组别的植原体株系。通过设计长片段pcr引物,进一步扩增了我国pawb-sdyz、pawb-fjfz和ly-fjya1植原体株系tuf基因及其上游6个基因rpll、rpob、rpoc、rps12、rps7、fusa序列,统计分析已研究的植原体基因启动子的保守区域序列特征。通过反转录pcr(reversetranscription,rt-pcr)等方法检测了植原体tuf基因及其上游部分基因在植原体中的转录表达情况。研究结果表明:扩增获得了pawb-sdyz、pawb-fjfz、ly-fjya1株系tuf基因上游12745-12748bp的序列,比较分析发现pawb-sdyz、pawb-fjfz、ly-fjya1、oy-m、aywb、paa、sly、at植原体株系tuf与其上游6个基因的结构顺序皆为5’-rpll-rpob-rpoc-rps12-rps7-fusa-tuf-3’。根据研究涉及的52个可能植原体基因启动子保守区域结构的序列特征,推测出可能的植原体基因启动子保守区域序列模式为:t90t100g92t75g67a85(-35区);t90a96t92a98t73t90(-10区)。基于8个植原体株系的rpll-tuf核苷酸序列编码基因、基因间区非编码序列、编码氨基酸序列的mlsa分析可将不同组别、不同亚组、不同寄主的植原体株系以较高的支持率清晰的区分,与rpll-tuf核苷酸编码区相比,不同植原体株系rpll-tuf核苷酸非编码区变异水平更高。通过植物化学手段抽提抗枣疯病枣树叶片中的活性成分,并检测枣树提取液对部分细菌的抑菌活性,利用高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography,hplc)等技术检测分析枣树提取液中相关抗病物质及其含量。通过用不同浓度枣树提取液处理枣疯病和泡桐丛枝病组培苗分析其对组培苗生长和症状的作用。研究结果表明:在已抽提的20份抗枣疯病能力不同、嫁接传病后的枣树提取液中均检测到水杨酸,且含量差异显著(P=0.0000.05)。茉莉酸仅在表现严重丛枝症状(IV-V级)的中抗品系87、138号枣树叶片提取液中检测到,而在表现严重丛枝症状的感病品系,和抗病接穗嫁接到病砧木上或表现轻症状(I-III级)或恢复无症(0级)的枣树叶片中皆未检测到;水杨酸甲酯和茉莉酸甲酯在20份抗病和感病枣树提取液中均未被检测到。不同的枣树材料甲醇提取液对坚强芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌等细菌的生长具有较为明显的抑制作用,143、55、103号抗病枣树材料提取液处理的蕈状芽孢杆菌抑菌圈直径在5.75~8.5mm之间,差异显著(P=0.0040.05)。枣疯病和泡桐丛枝病组培苗外植体会因MS培养基中甲醇溶剂和枣树提取液浓度过高而产生药害或致死。MS培养基中甲醇或枣树提取液含量变化会对枣疯病和泡桐丛枝病组培苗外植体生长和症状有一定的影响。多位点序列分析可做为一种对植原体鉴定、区分以及株系遗传多样性全面检测的有效、可靠的方法。在以后的研究中该方法可广泛应用于深入探讨植原体不同组间或亚组间株系的遗传变异和系统发育关系。关于植原体启动子、相邻基因结构解析和枣树抗病物质研究所建立的方法和所获得的结果有助于对植原体关键基因结构、代谢调控、遗传变异规律等的深入研究和理解,为揭示植原体生长与繁殖、生境多样性和适应性、与寄主植物和介体昆虫的互作关系、致病机理和枣树抗病机制奠定了坚实基础。对于进一步筛选和开发新型枣疯病及其它植原体病害治疗药剂和充分合理利用抗病资源、增强植物抗病能力和降低因病菌变异导致的寄主抗病性丧失,从根本上提高植原体病害的综合防治水平等都具有较为重要的理论意义和实用价值。


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