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《中国林业科学研究院》 2014年
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杨树抗逆转录因子基因遗传转化与功能验证

张伟溪  
【摘要】:林木作为重要的可再生资源,对维持和保护生态环境具有重要作用,随着目前生态系统退化情况加剧情况的加剧,林木的产量和质量及森林生产力受到严重影响。因此培育抗逆林木新品种,改良利用干旱、半干旱及盐碱荒地,推动土地资源的开发利用,改善环境资源,已经成为当前研究热点。基因工程技术可以从基因水平上改良林木的目的性状,为林木遗传改良育种开辟新的途径。本研究以杨树新品种凌丰2号杨(Populus×euramericana cl.?Lingfeng 2‘)为受体材料,采用农杆菌介导法首次进行三个抗逆转录因子基因——茉莉酸乙烯应答元件基因(JERF36)、锌指蛋白基因(ZxZF)、ABA响应元件结合蛋白基因(ckAREB)多组合遗传转化研究。通过室内抗性生理测定,根系Na~+、K~+、H~+离子流测定,定量抗逆相关基因表达,进行转基因杨树抗逆能力测定,获得抗性效果显著的转基因杨树。本研究对多组合转录因子导入改良杨树抗性作用机制的探讨及转录因子基因在林木育种中的应用,培育高效林木基因工程新品种具有一定的理论指导意义。论文主要研究结果如下:1.成功构建抗逆转录因子双基因载体和三基因植物表达载体。首次将来源于强旱生灌木霸王(Zygophyllum xanthoxylum)的锌指蛋白基因(ZxZF)和柠条(Caragana Korshinskii)的ABA响应元件结合蛋白基因(ckAREB)及来源于草本植物番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)的茉莉酸乙烯应答元件基因(JERF36)三个不同调控途径转录因子以多种组合方式构建到同一植物表达载体上,成功构建JERF36-ckAREB双基因植物表达载体(pBIJEAR)及ZxZF–ckAREB-JERF36三基因植物表达载体(pMDCZXARJE),实现多抗逆调控基因相对稳定串联。2.建立欧美杨新品种高效再生体系及遗传转化体系,攻克了黑杨派树种组培再生率低技术难题。确定叶片、叶柄最佳分化培养基为:MS~+6–BA 0.5 mg·L~(-1)~+NAA 0.05 mg·L~(-1);再生芽最佳生根培养基为1/2 MS~+IBA 0.01 mg·L~(-1)~+NAA 0.01 mg·L~(-1);确定卡那霉素选择压为30 mg·L~(-1),潮霉素选择压为5 mg·L~(-1)。利用该体系进行欧美杨组培再生时,叶片、叶柄最高分化率和生根率均可达100.00%之间,其中每叶片平均再生芽可达20个,每叶柄平均再生芽数最高可达11个。利用该体系对凌丰2号杨进行农杆菌介导遗传转化,获得1581株抗性植株,通过pcr、qrt-pcr分子检测,成功获得不同转录因子基因成功整合并稳定表达的转基因杨树植株53株,包含转单基因植株41株,其中,zxzf转基因植株7株,ckareb基转因植株6株jerf36转基因植株28株,获得双基因(jerf-ckareb)转基因植株12株。3.抗逆转录因子基因导入有效提高转基因杨树抗逆性,多调控途径转录因子优于单调控途径转录因子。通过室内模拟干旱及耐盐生理测定结果表明转jerf基因株系lj6在盐胁迫下表现优良,其脯氨酸含量、sod活性、pod活性分别超过非转基因株系5.39%、150%及24.07%,其细胞膜相对透性低于非转基因株系26.55%,且该转基因株系在模拟干旱胁迫条件下也表现出一定抗性;转ckareb基因株系ga51在peg模拟干旱胁迫条件下表现优良,其fv/fm、相对含水量、脯氨酸含量、sod、pod活性均超过非转基因株系,其脯氨酸含量显著超过非转基因株系187.56%,而细胞膜相对透性和mda含量均低于非转基因株系,且该株系在盐胁迫条件下也表现出一定抗性;转双基因(jerf-ckareb)株系ga39抗旱、耐盐能力强于转但转录因子基因株系,如其叶绿素含量,脯氨酸含量均分别超过盐胁迫下及干旱胁迫下转jerf基因株系lj613.8%及17.05%,mda含量分别低于盐胁迫下及干旱胁迫下转jerf基因株系lj654.27%及42.84%,脯氨酸含量、sod、pod活性分别超过干旱胁迫下转ckareb基因株系ga4932.62%、12.21%、84.76%。利用非损伤微测技术(扫描离子选择微电极技术,site)对转基因杨树根系na~+、k~+、h~+离子流测定研究表明,与非转基因株系相比,模拟干旱胁迫下转双基因株系(laj12、laj29)na~+、h~+外排趋势,k~+外内流趋势明显,转ckareb基因株系(ga49、ga51)na~+、k~+离子外排,h~+离子内流趋势明显;盐胁迫下转双基因株系gaj39及转jerf基因株系lj42根尖区域na~+流外排速率升高,k~+内流减弱,并有外排趋势,h~+流外排趋势显著。因此,转基因株系根细胞在胁迫条件下具有较强质子泵活性,且双基因株系根细胞质子泵活性高于转单基因株系,转基因杨树抗旱、耐盐能力均获得提高,且转双基因杨树抗性高于转单基因杨树。4.外源转录因子导入有效调控转基因植物抗逆相关基因表达,多转录因子整合导入更能稳定调控基因表达。通过定量转基因杨树内抗逆相关基因表达,验证转录因子对抗逆相关基因表达影响,转录因子基因的导入可不同程度促进抗逆基因(Enolase、P5CS、SPDS及WCOR413-like protein)的上调表达;转ckAREB基因株系GA51的SPDS基因在模拟干旱胁迫及盐胁迫下表达量均较高,且上调表达,而其WCOR413-like protein基因在仅在干旱胁迫下表达量较高;转JERF基因株系LJ42 P5CS基因在模拟干旱胁迫下表达量较高且呈上调表达;各转基因株系WCOR413-like protein在正常供水条件下呈下调表达,而在模拟干旱及盐胁迫条件下表达方式不同(上调或下调);转双基因株系GAJ39中Enolase、P5CS、SPDS抗逆相关基因的表达量在正常供水、PEG模拟干旱胁迫及盐胁迫条件下普遍高于转单基因株系,且呈上调表达。总体来看转双基因株系中抗逆相关基因表达量高于转单基因株系,转单基因株系中抗逆基因表达量高于非转基因株系,推测2类转录因子在发挥功能时具有交互作用,可以协同调控抗逆相关基因表达,从而增强转基因植株抗旱、耐盐能力。
【学位授予单位】:中国林业科学研究院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:S792.11

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