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尾赤桉再生体系及农杆菌介导的转基因体系研究

范春节  
【摘要】: 本文以尾赤桉无性系DH201-2的叶片和茎段为外植体建立了高效的再生体系,并初步建立了根癌农杆菌介导的遗传转化体系,获得了km抗性植株,研究结果为今后的桉树转基因技术、转基因育种和功能基因组学研究奠定了基础。主要研究结果如下: 1.通过对外植体的筛选、激素种类和浓度的调整、培养条件的选择,取自生根培养基上培养30天植株的上部和中部的茎段在mMS+TDZ 0.05mg.L~(-1)+NAA 0.50 mg.L~(-1)的培养基中获得高达57.0%的植株再生;取在生根培养基上培养20天的植株,顶端起第2~4片叶片在mMS+ TDZ0.05 mg.L~(-1)+IBA 0.1 mg.L~(-1)的培养基中获得48.3%的植株再生;适合于茎段和叶片不定芽分化的Ca(NO3)2浓度为0.706 g.L~(-1)。 2.尾赤桉无性系DH201-2对卡那霉素具有一定的本底抗性,叶片外植体的卡那霉素抗性达到90mg.L~(-1);茎段外植体的浓度在120mg.L~(-1),植株达到更高的水平150mg.L~(-1)。 3.当培养基中的头孢霉素达到300mg.L~(-1)时,叶片和茎段仍然保持很高的再生率,且再生植株的形态良好,且能够很好的杀死和清除农杆菌,经过3次每次各15天的培养后极少有农杆菌生长。 4.GV3101,EHA105,LBA4404和C58C1四种农杆菌菌株的转化效率比较发现,菌株GV3101对尾赤桉无性系DH201-2的转化效率最高,叶片外植体的gus瞬间表达率达到30%,茎段外植体达到70%。 5.经过预培养6天的茎段外植体在农杆菌光密度OD600为0.4~0.5的菌液中浸泡30mins,然后转移到pH值5.6的共培养培养基中共培养4天,达到最高的转化效率;经过预培养3天的叶片,在光密度OD600为0.4~0.5的农杆菌菌液中浸泡30mins,然后转移到pH值5.6的培养基中共培养3天,达到最高的转化效率。 6.茎段外植体转化中在农杆菌菌液中和共培养培养基中添加100μM乙酰丁香酮转化效果最好;叶片外植体转化研究中,在共培养培养基中添加100μM乙酰丁香酮转化效果最好。 7.茎段具有较高的转化效率,平均转化效率大于50%,最高达到70%;而叶片外植体的转化率偏低,平均转化效率约30%,最高也只有47%。201-2的茎段作为外植体更适于转基因研究。


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