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《中国林业科学研究院》 2008年
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千年桐硬脂酸脱饱和酶、油酸脱氢酶基因克隆及真菌遗传转化研究

范妙华  
【摘要】: 生物柴油是一种可再生清洁能源。我国丰富的油料植物资源是制造生物柴油的理想原料,但以油菜(Brassica campestris)、大豆(Glycine max)等油料作物和木本油料种子为材料制造生物柴油,存在原料不足、成本高的问题。以微生物为原料可以通过生物反应器达到工业化生产的目的,从而解决生物质能源的材料来源问题,但现有的产油菌株存在产油率低、油脂成分复杂等问题。近年来,随着生物工程技术的发展,人们可以通过分子生物学方法来调控脂肪酸代谢途径,进而得到符合需求的功能性油脂。 本研究通过RT-PCR方法,从种子含油量高的木本油料树种——千年桐(Vernicia montana)中成功克隆到植物单不饱和脂肪酸合成的两个关键基因VeSAD和VeFAD2cDNA编码区全长,长度分别为1191bp和1152bp,在GenBank上成功登录(登录号分别为:EU072353、EF152993),并用分子生物学软件对其编码框的结构和功能进行分析。研究发现VeSAD编码蛋白序列与麻疯树(Jatropha curcas)、蓖麻(Ricinus communis)、油菜的同源性均达80%以上。功能区分析显示该酶具有可溶性脂酰-ACP脱饱和酶特有的保守区域,而不具有其它膜结合蛋白酶的功能区,属于△9硬脂酸脱饱和酶类。千年桐VeFAD2编码蛋白与本属植物油桐(Vernicia forddi)同源性为100%,与麻疯树为90%,与其它油料树种同源性也达81.2%左右,编码蛋白是个相对保守的多肽。对FAD2基因编码蛋白的结构及功能分析发现,VeFAD2蛋白三维结构不但含有脂肪酸脱饱和酶所共有的保守功能区域结构,还有△12脱饱和酶特有的功能区,属于油酸脱氢酶类。 根据两个基因在脂肪酸代谢中的催化作用,构建VeSAD基因在真菌中的正义表达载体pCAM2300-sad,VeFAD2基因的反义表达载体pBI121-fad2。 通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法进行真菌遗传转化,与以往的原生质体-PEG介导法、醋酸锂转化法、电击转化法等相比,具有转化效率高、操作方便的优点。本研究对农杆菌介导的丝状真菌和酵母遗传转化中一些关键因子进行研究,最终建立适合少根根霉(Rhizopus arrhizus)和浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)转化的较佳体系。少根根霉孢子浓度与根癌农杆菌菌液浓度比例在1:50-100,21℃共培养18 h后转到选择培养基上筛选,没有转化的菌丝因缺少营养逐渐死去,初选得到的根霉菌丝密度较小,便于后续鉴定。浅白隐球酵母与根癌农杆菌菌液浓度比例为1:200-300,25℃共培养35 h后。在选择培养基上观察得到的酵母菌落数目较多,容易进行后期的转化鉴定。本结论为下一步研究产油真菌奠定了基础。
【学位授予单位】:中国林业科学研究院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q943.2

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 陈东亮;根癌农杆菌介导的千年桐SAD基因对产油酵母的遗传转化[D];中国林业科学研究院;2010年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
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8 张震;杜新法;柴荣耀;毛雪琴;邱海萍;王艳丽;王教瑜;孙国昌;;对稻曲病菌T-DNA插入突变体若干生物学性状的分析[A];2005年华东植物病理学术研讨会论文集[C];2005年
9 方丽;宋凤鸣;;农杆菌介导的黄瓜炭疽菌遗传转化[A];2005年华东植物病理学术研讨会论文集[C];2005年
10 张震;杜新法;柴荣耀;毛雪琴;邱海萍;王艳丽;王教瑜;孙国昌;;根癌农杆菌介导遗传转化稻曲病菌[A];2005年华东植物病理学术研讨会论文集[C];2005年
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3 傅晓萍;美洲商陆镉吸收和耐性机理研究[D];浙江大学;2011年
4 刘宏波;甘蓝型油菜抗病虫基因遗传转化及转基因植株抗性鉴定的研究[D];浙江大学;2010年
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10 范雅;高压和低温下不饱和脂肪酸相变的原位拉曼谱研究[D];吉林大学;2011年
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1 王术娥;罗非鱼营养、挥发性成分及质构特性研究[D];华中农业大学;2010年
2 张月兴;利用基因芯片解析金柑和纽荷尔应答溃疡病的转录差异[D];华中农业大学;2010年
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6 高岩;拟南芥fad8基因在烟草叶绿体基因组表达研究[D];哈尔滨师范大学;2010年
7 王威浩;油茶FatB基因的全长cDNA克隆[D];中南林业科技大学;2009年
8 李魏;油茶β-酮脂酰-CoA合酶基因的全长cDNA克隆[D];中南林业科技大学;2009年
9 孔凡敏;产油脂酵母菌株的选育[D];山东农业大学;2010年
10 杨悦;桑树内生真菌菜豆壳球孢菌MOD-1产油脂发酵条件优化及利用淀粉厂废水的研究[D];山东农业大学;2010年
【同被引文献】
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1 周晓航;刘洪章;;根癌农杆菌转基因的分子机制[J];吉林农业科学;2007年01期
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中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 张君胜;根癌农杆菌介导产甘油假丝酵母转化研究[D];江南大学;2006年
【二级参考文献】
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9 黄永红;易干军;周碧容;曾继吾;吴元立;;香蕉基因工程研究进展[J];西北植物学报;2006年10期
10 郭军;张洪;丁可;代西维;陈玥颖;段迎辉;黄丽丽;康振生;;小麦条锈菌PsNCS1基因的克隆及转录表达特征[J];微生物学报;2010年07期
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10 吴江;陈波水;方建华;王九;;生物柴油的润滑性及机理研究[A];2011中国功能材料科技与产业高层论坛论文集(第一卷)[C];2011年
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6 周洁;我省首个生物柴油厂年内有望投产[N];江苏经济报;2006年
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10 晓玲;华中农大已生产约3吨生物柴油[N];粮油市场报;2006年
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3 邢继红;拟南芥抗灰葡萄孢相关基因的克隆和功能分析[D];河北农业大学;2006年
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8 李伟;圆锥小麦地方品种遗传多样性研究[D];四川农业大学;2006年
9 段冷昕;梅花鹿茸多肽的化学结构及其抗肝纤维化作用[D];吉林大学;2007年
10 倪多娇;栉孔扇贝抗氧化酶基因的克隆与表达分析[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2007年
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1 范妙华;千年桐硬脂酸脱饱和酶、油酸脱氢酶基因克隆及真菌遗传转化研究[D];中国林业科学研究院;2008年
2 金苹;根癌农杆菌介导ACS反义基因转化文心兰的研究[D];福建农林大学;2009年
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4 李娜林高娃;生物柴油合成新工艺研究[D];内蒙古大学;2010年
5 丁荣;固定化脂肪酶催化光皮树油脂合成生物柴油[D];中南大学;2010年
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8 王红娜;气升式反应器两步法生产生物柴油实验研究[D];郑州大学;2010年
9 李瑞贞;竹废料微波辅助裂解制备生物柴油抗氧化剂的研究[D];南昌大学;2010年
10 王友东;固定化重组脂肪酶催化木本植物油脂制备生物柴油研究[D];南京林业大学;2010年
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